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近年,我们从桑花叶卷叶病叶组织中发现一种新的球状病毒和一种新的小分子环状RNA,为了阐明该病毒及小分子环状RNA的生物学和分子生物学特征以及与该病发生的关系,本研究将：1.利用锚定随机引物及5’,3’-RACE对新发现病毒的基因组序列进行克隆,分析基因组的分子特征,确立分离出的病毒的分类地位；建立病毒抗血清新的制备方法并建立病毒的血清学检测方法；利用RT-PCR对病毒进行检测并根据检测结果提出病毒与桑花叶卷叶病发生的关系；2.继续对先前分离出的小分子环状RNA(Mulberry small circular RNA, mscRNA)进行研究,克隆mscRNA的全长序列,分析其分子结构特征；通过回接mscRNA以及构建的mscRNA侵染性克隆,确定mscRNA是否具有侵染性,揭示mscRNA与桑花叶卷叶病的关系；建立灵敏、快速、可靠的分子检测方法对不同地区的病桑进行检测,并根据检测结果提出nscRNA与桑花叶卷叶病发生以及症状表现的关系。结果如下：1.通过电子显微镜观察,桑花叶卷叶病叶中的球状病毒粒体直径为28-30nm。其基因组由2条正单链RNA(ssRNA)组成,RNA1和RNA2的全长分别为7183nt和3742nt[都不包括poly(A)尾的长度],2条RNA链都只包含一个开放阅读框,RNA1的开放阅读框编码一个由2102aa组成,相应分子量约为235.1kDa的多聚蛋白P1,RNA2的开放阅读框编码一个由1093aa组成,相应分子量约为120.5kDa的多聚蛋白P2；基于P1的氨基酸序列构建的进化树表明,该病毒属于线虫传多面体病毒属(Nepovirus)病毒；P1的氨基酸序列包含Hel、VPg、RdRp保守性氨基酸基序以及半胱氨酸蛋白酶(Pro)的催化三联体；该病毒外壳蛋白位于P2的C端,运动蛋白位于P2的N端,通过NetPicoRNA1.0Server软件预测以及Western blot分析,推测运动蛋白与外壳蛋白之间的切割位点位于553E/V554,这个切割位点以前未曾报道过,是3CL (pro)一个新的切割位点,切割后产生一个分子量约为59kDa的外壳蛋白。基于外壳蛋白氨基酸序列构建的进化树分析、RNA2的核苷酸序列长度、RNA1和RNA2的3’-UTR和5’-UTR的核苷酸序列特征以及国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)第九次报告提出的Nepovirus新病毒认定标准(与其它Nepovirus病毒比较,外壳蛋白的氨基酸序列的相似性<75%),该病毒属于Nepovirus属A亚组的一种新病毒。由于该病毒最初是从桑花叶卷叶病的叶组织中分离出来的,其与桑花叶卷叶病的关系还没有通过Koch’s法则确定,我们暂时将该病毒命名为桑花叶卷叶病相关病毒(MulberryMosaic Leaf Roll-associated Virus, MMLRaV)。RT-PCR的检测结果显示,从浙江省湖州市、江苏省海安县和江苏省镇江市的桑园中采集到的61份表现桑花叶卷叶病症状样品中,58份样品检测出含有MMLRaV,病毒的侵染率高达95%,这个结果说明,MMLRaV在浙江和江苏的桑园中普遍存在,绝大多数表现桑花叶卷叶病症状的桑树均受到MMLRaV的侵染,MMLRaV与桑花叶卷叶病的发生有着明显的关联。2. mscRNA浙江分离株mscRNA-zj是由356nt核苷酸组成,G+C含量为51.12%,经过BLAST比对,mscRNA-zj序列与已报道的Mulberry small circular viroid-like RNA1isolate201110151(JQ809700)和Mulberry small circular viroid-like RNA1(EU547491)的序列的相似性高达99%,然而,我们通过实验获得的mscRNA-zj序列与已报道这2个分离株的极性相反。通过(?)fold预测mscRNA的最稳定的二级结构呈支链状,在37℃下,这种结构的最低自由能是-601.6kJ/mol,链内65.7%的碱基能够配对,比以前报道的浙江株和陕西株2个分离株的最低自由能更低,链内碱基配对比例更高,mscRNA-zj支链状二级结构与鳄梨日斑类病毒科(Avsunviroidae)类病毒和一些病毒的环状单链卫星RNA的支链状二级结构相似。mscRNA-zj的正链上含有锤头型核酶,根据锤头型核酶的自我切割特性推测了mscRNA-zj复制过程中自我切割位点的位置。不同地理分布的mscRNA存在序列多样性。LiCl法提取的mscRNA以及构建的侵染性克隆的接种结果显不,]mscRNA-zj单独存在是不能在其自然寄主-桑树体内自我复制,也不能在鉴别寄主-番茄中自我复制,初步认为mscRNA是一种桑树病毒的卫星RNA而不是一种新的类病毒。通过建立的单管一步RT-PCR对田间发生的桑花叶卷叶病的检测,结果显示,mscRNA不仅与桑花叶卷叶病的症状表现没有明显的关系,而且与该病的发生没有明显的关联。结论：MMLRaV是一种新的线虫传多面体病毒,归属于该属的A亚组,与桑花叶卷叶病的发生有着紧密的关联；mscRNA是一种桑树病毒的单链环状卫星RNA,而不是一种类病毒,与桑花叶卷叶病的发生和病害的症状表现没有明显的关联。