论文部分内容阅读
甲基叔丁基醚(Methyl Tert-Butyl Ether,MTBE)作为一种添加剂被广泛地应用于化工生产及医药制造中,然而其在生物机体内的毒性研究甚少。秀丽隐杆线虫在土壤中分布广泛,具有较强的适应能力,基因组序列完整,在实验室中培养方便,并对外部环境较为敏感,因而其作为模式生物被广泛地应用于环境毒理学研究中。本研究将秀丽隐杆线虫置于0-100 mg/L的MTBE的溶液中分别暴露1 d和10 d,从生理、生化和分子水平三个层面来研究MTBE对秀丽隐杆线虫的急性(1d)和慢性(10 d)神经毒性效应。(1)在生理指标层面,秀丽隐杆线虫的体长、身体弯曲频率、头部摆动频率和探索行为均受到了 MTBE不同程度的抑制作用,且具有一定的剂量-效应关系。慢性暴露造成的抑制情况与急性暴露相比更为显著。线虫的身体弯曲频率与其他指标相比较为敏感,在10 mg/L的MTBE急性暴露和1 mg/L的MTBE慢性暴露下,线虫的身体弯曲频率与对照组相比显著降低(p<0.05)。探索行为的敏感性次之,在100 mg/L的MTBE急性暴露和10 mg/L的MTBE慢性暴露下,线虫的探索行为与对照组相比显著降低(p<0.05)。身体弯曲频率和探索行为指标可作为MTBE对秀丽隐杆线虫神经毒性效应的生理层面上敏感的筛选指标。(2)在生化指标水平上,MTBE会干扰秀丽隐杆线虫活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)、细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)和磷酸化细胞外信号调节激酶(Phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)的生成。与对照组相比,100 mg/L的MTBE急性暴露会造成ROS增加35.47%,0.01 mg/L的MTBE的慢性暴露会使秀丽隐杆线虫体内的ROS水平增加33.38%。与对照组相比,100 mg/L的MTBE急性暴露会使ERK含量增加10.27%,0.1 mg/L的MTBE慢性暴露会使秀丽隐杆线虫的ERK增加11.49%。除此之外,与对照组相比,10 mg/L的MTBE急性暴露会使p-ERK增加32.54%,0.01 mg/L的MTBE慢性暴露会使秀丽隐杆线虫体内的 p-ERK 增加 44.53%。此外,在用氨基丁酸 A(aminobutyric acid A,GABAA)受体激动剂(麝香酚)刺激后,ROS和生理指标的改变意味着GABAA受体受损。与慢性暴露相比,急性暴露对秀丽隐杆线虫的GABAA受体损伤更小。ROS、ERK和GABAA受体反映了神经系统的动态平衡。(3)由于MTBE慢性暴露对秀丽隐杆线虫的影响较大,通过qRT-PCR分析MTBE对秀丽隐杆线虫暴露10 d后其体内mRNA水平的变化。结果表明,sod-1和unc-47基因的表达显著增加,unc-49基因表达显著性下降。GABAA受体在ROS的调节中起消极作用,而ERK与ROS的调节呈正相关。结合Pearson相关性分析结果,进一步采用突变体品系秀丽隐杆线虫CB382和CB407检验unc-49基因对线虫的作用,CB382突变体品系线虫与野生型相比,ERK的含量无显著性差异,p-ERK的含量显著性增加,证明GABAA受体受损。在MTBE慢性暴露下,由绿色荧光蛋白标记的转基因品系秀丽隐杆线虫EG1653,对照组中(0 mg/L)的处理液中线虫腹侧荧光明显比背侧荧光丰富。暴露于100 mg/L的MTBE时,与对照组相比,秀丽隐杆线虫头部、背侧和腹侧的荧光强度显著降低,其中背部神经元更为敏感。综上所述,在急性暴露条件下,当MTBE浓度为10-100 mg/L时,秀丽隐杆线虫的体长、头部摆动频率、身体弯曲频率以及探索行为发生不同程度的负面影响。同时,当MTBE浓度为10-100 mg/L时,ROS含量、ERK和p-ERK显著增加。在慢性暴露条件下,当MTBE浓度为0.1-100 mg/L时,秀丽隐杆线虫的体长、头部摆动频率、身体弯曲频率以及探索行为发生不同程度的负面影响。同时,当MTBE暴露浓度为0.01-100 mg/L时,ROS含量、ERK和p-ERK显著增加,且GABAA受体发生损伤。对慢性暴露的指标进行Pearson相关性分析,结果表明,unc-49基因与秀丽隐杆线虫的生理和生化指标密切相关。结合突变体品系及转基因品系秀丽隐杆线虫的应用,发现unc-49基因可能通过p-ERK调节外界干扰,其中背部神经元更为敏感。因此,秀丽隐杆线虫可用于MTBE的神经毒性效应评价,研究结论可为MTBE污染生态风险评价和环境管理提供毒理学参考依据。