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近年来快速发展的对流PCR技术,因具有扩增速度快、耗能低且仪器简易等优点而备受关注。然而,反应管内类似于同心椭圆型的多层流路流场所导致的扩增灵敏度及稳定性差等问题一直是对流PCR技术难以突破的瓶颈。本课题组在前期研究工作中,通过在反应管中加入挡板(即插片管)建立了一种可控制管内环流路径的对流PCR技术,提高了管内环流的均一性和稳定性,从而使对流PCR扩增灵敏度、特异性以及稳定性均显著提高。目前实验室使用插片管中的挡板由手工制备,个体间存在差异性,且反应管受模具开发的尺寸限制,无法在其中设计与挡板相契合的卡槽,挡板在反应管中的位置和角度很难精准的把控。因此,目前使用的插片管仍然存在三个问题:一是反应管制备难度高,受过专业化培训的技术人员方能完成实验操作;二是插片管制备过程过多受人为因素影响,管间差异无法避免,不仅难以实现产业化,而且难以应用于科学研究、临床检测和现场检测等领域中;三是管间差异所导致的环流不完全一致性大大限制了对流PCR技术在定量检测方面的应用。因此,本文围绕上述问题将开展以下研究:1.建立一种环流均一、稳定扩增且可应用于商业化生产的对流PCR平台。在原先手工插片管设计参数的基础上结合模具厂商要求的最小开模尺寸,设计了一种管间高度均一的开模插片管,此插片管中的挡板由开模设出,反应管内部设有与挡板相契合的卡槽,插片管的组合只需将挡板沿着卡槽插入反应管即可,操作极其简便。同时,通过大量的实验摸索,确定了针对开模插片管的加热参数,并且最终的扩增评价结果表明,开模插片管的检测下限可达5copies/test,可以满足临床检测、现场检测和科学研究等领域的需要。2.建立了一种基于稳定环流的荧光定量对流PCR平台。本研究在开模插片管稳定、均一的环流基础上加入了荧光检测装置。通过光学系统的优化,包括挡板与入射光的角度、入射光强度、荧光采集的相机曝光时间等,荧光对流PCR技术表现出了明显的定量性能。总之,本研究开发了一种扩增稳定,可商业化生产的对流PCR扩增平台,并在此基础上初步展现了其定量检测性能。不仅解决了手工插片管管间差异大、操作难度高、难以大规模应用的问题,而且直观的体现了对流PCR技术定量的可能性,推动了对流PCR技术的发展和应用。