研究目的:创伤性脑损伤(TBI)是全世界重要的公共卫生问题,其所致的继发性损伤促进认知障碍的发生发展。小胶质细胞是中枢神经系统常驻的免疫细胞,是对抗疾病或损伤的第一道防线,其激活后的极化状态决定了继发性损伤和神经保护作用。因此,干预小胶质细胞极化状态可能是改善TBI远期认知障碍的关键靶点。TLRs是介导先天免疫的受体家族,特别是TLR4被认为是小胶质细胞活化的主要调节因子。TLR4在小胶质细胞中高度表达,在调节TBI后慢性炎症反应和启动继发性损伤中发挥至关重要的作用。我所在研究团队前期实验发现TBI慢性期脑组织中小胶质细胞以M1型为主,促进神经炎症,引发认知障碍。本课题将进一步阐明TLR4在调节小胶质细胞极化表型,改善TBI远期认知障碍的作用及机制,为TBI治疗新方法提供理论依据。研究内容与方法:1.通过免疫荧光及Western Blot检测TLR4,验证TAK242(TLR4抑制剂)可以有效抑制TLR4的表达;通过改良神经功能评分及Morris水迷宫实验,评价TLR4的表达对rmTBI小鼠神经功能及远期空间学习记忆的影响。2.应用Western Blot检测APP、p-Tau蛋白,评价TLR4对rmTBI小鼠病理性蛋白表达的影响。3.借助免疫荧光及Western Blot技术在体内体外实验中检测M1型小胶质细胞及M2型小胶质细胞表达情况及定量分析;应用ELISA技术检测炎症因子;探讨TLR4对rmTBI后急慢性期小胶质细胞极化表型及炎症因子释放的影响。4.体内体外实验,应用免疫荧光及Western Blot技术检测TLR4及下游蛋白Myd88、NF-κB的表达变化,明确TLR4及重要下游信号分子Myd88、NF-κB是否参与调控TBI后小胶质细胞极化表型及神经炎症反应。结果:1.(1)rmTBI急慢性期均出现TLR4表达升高,TAK242可以有效的抑制TLR4的表达。(2)rmTBI后急性期小鼠出现明显神经功能缺损,随着损伤时间延长,神经功能缺损逐渐恢复;在rmTBI后慢性期出现明显学习记忆能力下降;进一步验证了rmTBI是神经退行性疾病的重要危险因素。(3)rmTBI后,抑制TLR4的表达可以促进rmTBI小鼠神经功能缺损修复。(4)rmTBI后,抑制TLR4的表达可以改善rmTBI小鼠慢性期空间学习记忆能力。2.(1)rmTBI后3d即出现病理性蛋白APP,p-Tau蛋白表达增加,随着损伤时间延长至28d(慢性期),APP,p-Tau蛋白表达增加更为显著。(2)在rmTBI后的急慢性期,抑制TLR4的表达可减少病理性蛋白APP及p-Tau蛋白的表达。3.(1)体外实验证实:LPS激活小胶质细胞,促进小胶质细胞向M1型极化,促炎因子释放增加,抑炎因子释放减少;抑制TLR4的表达可促进小胶质细胞向M2型极化,抑炎因子释放增加,促炎因子释放减少。(2)体内实验证实:rmTBI后小胶质细胞激活,急性期M1,M2表达均有明显增高,炎症因子表达失衡;进入慢性期,M1型小胶质细胞仍持续激活,促炎因子释放增加,促进病理性蛋白累积,引起rmTBI远期认知障碍。在rmTBI急慢性期,抑制TLR4表达可使M1/M2比例显著下降,促进活化的小胶质细胞向M2型极化,增加抑炎因子释放,减少病理性蛋白的表达,最终改善认知功能。4.(1)通过免疫荧光双标记TLR4及小胶质细胞标志物Iba1,发现rmTBI后急慢性期较多的TLR4共定位于小胶质细胞,而假手术组仅有较少的TLR4共定位于小胶质细胞;TAK242干预后,较PBS组共定位于小胶质细胞的TLR4显著减少。(2)LPS损伤与rmTBI后,TLR4及下游信号分子蛋白Myd88、NF-κB的表达均显著升高,予TAK242干预后,TLR4及下游信号分子蛋白Myd88、NF-κB的表达较PBS组有显著下降,提示TLR4及下游信号因子Myd88、NF-κB参与调控rmTBI后的小胶质细胞极化及神经炎症反应。结论:1.TBI后,抑制TLR4表达可下调其下游信号分子Myd88、NF-κB的表达水平,降低小胶质细胞M1/M2比例,促进小胶质细胞向M2型极化;其次,抑制TLR4表达可促进抑炎因子释放,抑制慢性期神经炎症反应,减轻继发性脑损伤,从而导致病理性蛋白APP,p-Tau蛋白表达减少,最终改善TBI远期认知障碍。2.TLR4是调节小胶质细胞活化表型的重要模式识别受体,影响神经炎症的进展以及神经变性的发生发展。因此TLR4可能是改善TBI远期认知障碍的有希望的干预靶点。3.TAK242是潜在的TBI治疗新策略。