低聚异麦芽糖（isomaltooligosaccharides,IMOs）是一类由2～5个葡萄糖残基以α-（1→6）糖苷键结合而形成的功能性低聚糖,其主要功能成分包括异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖。低聚异麦芽糖是一类重要的益生元,具有促进肠道有益细菌的增殖及提高人体免疫力等功能,已经在食品工业中大量应用。低聚异麦芽糖的制备主要是以淀粉为原料,经液化和糖化得到麦芽糖浆之后,利用α-葡萄糖苷酶的转苷活性将葡萄糖残基转移到麦芽寡糖的非还原端合成IMO。目前被广泛用来合成低聚异麦芽糖的是来源于黑曲霉的GH31家族的α-葡萄糖苷酶,但是其存在转苷效率低、温度稳定性不够高、价格昂贵、来源不稳定等问题,是限制低聚异麦芽糖生产的一个关键因素。持续挖掘具有优良酶学性质的新型的GH31家族的α-葡萄糖苷酶并实现其高效异源表达是提升目前国内低聚异麦芽糖合成效率和产品质量的一个重要手段。本研究利用数据库挖掘的手段分析了嗜热真菌来源的α-葡萄糖苷酶,选取了嗜热毁丝霉来源的两个α-葡萄糖苷酶（MT31α1和MT31α2）,并在毕赤酵母中实现了它们的异源表达和纯化,对它们的生化性质、反应动力学和转糖苷的产物进行了系统研究。为了实现α-葡萄糖苷酶的高效表达,本研究还进一步探究了以里氏木霉为异源宿主进行α-葡萄糖苷酶的异源表达。本研究取得的主要研究结果如下:1.丝状真菌来源的GH31家族α-葡萄糖苷酶的数据库挖掘和分析。基因组分析发现黑曲霉中有5个GH31家族的α-葡萄糖苷酶,其他常见丝状真菌包括构巢曲霉、烟曲霉和米曲霉中分别具有4、2和3个GH31家族的α-葡萄糖苷酶。其中黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶AgdA经常被报道用于低聚异麦芽糖合成,但是其温度稳定性较低,而构巢曲霉来源的GH31家族α-葡萄糖苷酶AgdB与黑曲霉的AgdA相比具有较强的转苷活力,但其水解活力弱于AgdA。为了能够挖掘到耐热性比较好的α-葡萄糖苷酶,我们进一步对几个嗜热真菌基因组进行了分析。在埃默森篮状菌和嗜热毁丝霉中分别鉴定到了 6个GH31家族的α-葡萄糖苷酶,在嗜热毛壳菌中鉴定到了 5个GH31家族的α-葡萄糖苷酶,而在疏绵状嗜热丝孢菌中只鉴定到了 1个GH31家族的α-葡萄糖苷酶。由于不同的α-葡萄糖苷酶具有不同的底物和产物特异性,为了初步确定能够以麦芽寡糖为底物合成低聚异麦芽糖的α-葡萄糖苷酶,我们对以上的酶分子进行了序列比对和进化分析。结果表明在米曲霉、烟曲霉、构巢曲霉、埃默森篮状菌、嗜热毛壳菌和嗜热毁丝霉中都发现了黑曲霉AgdA的同源蛋白,它们与AgdA的序列一致性分别在58.15%到78.33%之间。同样在米曲霉、烟曲霉、构巢曲霉、嗜热丝绵菌、嗜热毛壳菌和嗜热毁丝霉中,也发现了构巢曲霉AgdB的同源蛋白,序列一致性在54.25%到81.77%之间。我们选取了嗜热毁丝霉的AgdA同源蛋白XP003658875.1（MT31α1）以及AgdB的同源蛋白XP003661084.1（MT31α2）进行序列分析和进一步的生化表征。保守结构域分析表明MT31α1 和MT31α2均具有保守的GH31家族的催化结构域和NtCtMGAMN结构域。序列比对表明MT31α1和MT31α2均具有GH31家族α-葡萄糖苷酶两个保守的区域region A和region B,在两个区域中也分别具有保守的催化氨基酸残基。MT31α1中介导催化的亲核试剂和酸碱催化剂分别为Asp495和Asp662,在MT31α2 中则分别为 Asp432 和 Asp617。2.MT31α1和MT31α2在毕赤酵母中的异源表达和生化性质分析毕赤酵母作为一种应用非常广泛的真核蛋白表达系统,具有操作简单,蛋白表达水平高,且可以进行复杂的翻译后修饰加工等优点。本论文将MT31α1和MT31α2基因分别克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并用电转法转入毕赤酵母GS115表达菌株中,成功实现了其异源表达。随后通过硫酸铵沉淀、透析、镍柱纯化及脱盐过程,获得了纯化的MT31α1和MT31α2重组蛋白,并对其酶学性质进行了系统分析。结果表明,MT31α1和MT31α2的最适温度分别为65℃和60℃,最适pH分别为4.5和6.5。MT31α1和MT31α2分别在55℃和50℃下保温24h均可以保持自身60%以上的酶活,在pH3～11也均能保持良好的稳定性。MT31α1的温度和pH稳定性显著高于报道的黑曲霉来源的GH31家族α-葡萄糖苷酶。除此之外,大多数金属离子和一些去污剂对两种重组酶的影响较小,仅有Ag+,Fe3+,Hg2+和SDS会使MT31α1和MT31α2失活。催化反应动力学分析表明MT31α1和MT31α2以pNPG为底物的水解反应符合Michael-Menten反应动力学。MT31α1的Km值显著低于MT31α2,说明其对pNPG亲和力高于MT31α2。MT31α1的Km值比报道的黑曲霉AgdA的Km略高,而Vmax约为黑曲霉AgdA的50%。MT31α1的Vmax是MT31α2的38.5倍。因此,MT31α1的pNPG水解活性（Vmax/Km）是MT31α2的150倍,是报道的黑曲霉AgdA的pNPG水解活性的33%。以麦芽糖为底物时,高浓度的麦芽糖对水解活力有抑制作用,并且其水解活力高于其转糖苷活力。3.MT31α1和MT31α2的转糖基产物分析MT31α1与30%的麦芽糖的底物进行反应,对反应产物进行1H NMR分析发现在δ4.99 ppm出现了一个新的异头碳的信号,这是α-（1→6）键的报告信号,说明形成的产物中含有α-（1→6）键。同样对MT31α2与30%的麦芽糖的底物产物进行1H NMR分析发现在δ 5.33 ppm出现了一个新的异头碳的信号,这是α-（1→3）键的报告信号,说明形成的产物中含有α-（1→3）。HPLC分析发现MT31α1以麦芽糖为底物首先合成的转糖基产物是潘糖;随着反应的进行麦芽糖逐渐消耗,葡萄糖积累,形成转糖基产物异麦芽糖和异麦芽三糖,反应的终产物中麦芽糖转化为IMO的转化率为40.86%±1.95。在未优化条件下,此转化率与目前异麦芽糖产品IMO50中的主要产物（异麦芽糖、潘糖和异麦芽）比例（35%）相当,因此MT31α1具有一定的工业应用前景。与MT31α1相比,HPLC分析发现MT31α2以麦芽糖为底物合成了两个丰度比较高的转糖基产物。LC-MS和NMR分析表明这两个产物结构分别 为 α-D-Glcp-（1→3）-α-D-Glcp-（1→4）-D-Glcp 和α-D-Glcp-（1→3）-α-D-Glcp-（1→3）-α-D-Glcp-（1→4）-D-Glcp。因此MT31α2 可以通过转糖基反应合成具有α-（1→3）键的低聚寡糖,并且其可以介导形成连续的α-（1→3）键。4.MT31α1和MT31α2在里氏木霉中的异源表达里氏木霉是工业上生产纤维素酶和半纤维素酶的主要菌株,具有强大的蛋白分泌能力,并且该真菌是美国FDA认证的食品安全级的工业生产菌株。为了实现α-葡萄糖苷酶的高水平表达,本论文进一步探究了以里氏木霉为异源宿主表达嗜热毁丝霉来源的α-葡萄糖苷酶MT31α1和MT31α2。利用实验室自主鉴定的里氏木霉高效tcu启动子,构建了 MT31α1和MT31α2的里氏木霉表达载体。同时为确保MT31α1和MT31α2的高效分泌,我们分别采取其自身分泌信号肽和主要纤维素酶组份CBHI的信分泌号肽与MT31α1和MT31α2融合表达。通过里氏木霉的转化子筛选和验证得到T.Reesei-α1-ZI、T.Reesei-α1-CBH1、T.Reesei-α2-ZI和T.Reesei-α2-CBH1菌株。通过对转化菌株发酵液的SDS-PAGE、蛋白浓度测定及pNPG酶活测定,我们发现T.Reesei-α2-Z1和T.Reesei-α2-CBH1随着发酵时间的增加,酶活和蛋白量均逐渐增加,在96 h时酶活分别达到最大值0.06和0.04 U/mL。与T.Reesei-α1-CBH1未检测到胞外酶活和MT31α1的蛋白分泌相反,虽然T.Reesei-α1-ZI的胞外蛋白表达量相对极低,但是其酶活水平最高,在96 h可以达到0.16 U/mL,这可能与MT31α1具有较高的pNPG水解能力有关,其在里氏木霉中的高水平分泌还有待进一步研究。