过氧亚硝酸根(ONOO￣,Peroxynitrite)作为生物体内高活性自由基,能损伤氨基酸、蛋白质、DNA、脂质等多种生物大分子,进而引起一系列重大疾病,因此对其在体内含量的测定和反应机制的研究具有重要生物学意义。目前,对其研究主要集中在其与酪氨酸在非酶条件下产生3-硝基酪氨酸的反应机制,而对含量测定方法的研究相对较少,且ONOO￣性质活泼,反应速率快,测定其含量测定较为困难,荧光探针法和非酶催化反应法是目前主要的测定方法。过氧化物模拟酶以血红素为辅基,是一种从植物、动物和微生物中提取出的氧化还原酶,对氢受体具有独特的活化作用,可以高效催化具有氢受体的物质。ONOO￣具有强氧化性,可以作为氢受体物质,基于过氧化物模拟酶能够催化氢受体ONOO￣和ONOO￣能够氧化酪氨酸的反应,建立了过氧化物酶测定ONOO￣的新方法,该方法克服了荧光探针合成困难和选择性差,非酶催化反应法灵敏度差等缺点。选取生物体内细胞中的最主要蛋白成分肌红蛋白、血红蛋白和氯化血红素三种过氧化物模拟酶,基于过氧化物酶能够催化过ONOO￣氧化酪氨酸的催化反应原理,建立模拟酶—ONOO￣—酪氨酸的催化体系,利用荧光光谱仪测定ONOO￣的含量。结果表明:利用过氧化物模拟酶对ONOO￣的催化作用,可以准确测定ONOO￣的含量;过氧化物酶催化的反应是对酪氨酸的静态淬灭过程;在过氧化物模拟酶的催化作用下,酪氨酸能够快速被ONOO￣氧化成酪氨酸二聚体,而不是被硝化为三硝基酪氨酸;肌红蛋白催化法测定ONOO￣的检出限为4.8×10-8mol·L-1,线性范围为4.8×10-6到4.8×10-4 mol·L-1;平均回收率为95.85%;血红蛋白催化ONOO￣氧化酪氨酸的检出限为2.4×10-8 mol·L-1,线性范围为2.2×10-6~8.8×10-4 mol·L-1;平均回收率为98.85%;氯化血红素的检出限为9.2×10-8mol·L-1,线性范围为9.6×10-6到4.2×10-4 mol·L-1;平均回收率为90.42%,效果较好。通过优化反应条件,比较三种模拟酶测定其含量不同的实验条件、线性范围及检出限,发现血红蛋白催化法测定ONOO￣的效果最好,对研究生物体产生的活性自由基含量的测定方法及该催化反应机理研究具有重要的生物学意义。首次利用了流动注射分析仪探究在不同模拟酶肌红蛋白、血红蛋白和氯化血红素的催化下,ONOO￣氧化酪氨酸体系的动力学特征。结果表明:ONOO￣在三种酶催化下氧化酪氨酸的过程均遵循Michaelis-Menten的动力学规律;根据米氏常数Km和最大初速率Vmax,推断其反应机制,经模拟酶催化的ONOO￣能直接氧化与模拟酶结合后的酪氨酸快速生成酪氨酸二聚体,未分解成·OH和·NO2等活性中间体,且反应中无O2·;此外还监测了不同温度、pH下的速率常数,以此来探讨三种模拟酶催化对二者反应的影响,得到肌红蛋白催化该体系的最适条件为30℃和pH 8.5,kcat=8.750×105 mol·L-1·s-1,血红蛋白为25℃和pH 8.0,kcat=1.035×106 mol·L-1·s-1,氯化血红素适宜在37℃和pH 9.5的条件下催化该体系,kcat=6.842×105 mol·L-1·s-1,其结果与荧光光谱法优化后的最佳反应条件一致;比较动力学参数Km Hb(4.46μmol·L-1)<Km Mb(4.78μmol·L-1)<Km Hemin(4.90μmol·L-1),Vmax Hb(0.072ΔIF/s)>Vmax Mb(0.036ΔIF/s)>Vmax Hemin(0.026ΔIF/s),发现最适条件下的速率常数大小依次为血红蛋白>肌红蛋白>氯化血红素,同样得到血红蛋白对于该体系的催化活性高于肌红蛋白,肌红蛋白高于氯化血红素。以上结果为探究酶催化法测定ONOO￣含量及其反应机理、对于防治生物体内自由基引起的相关疾病诊断新技术的开发提供动力学参数和理论依据。