环丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)属于氟喹诺酮类抗菌药物,因其药物吸收迅速、生物利用度高、体内分布广泛、耐药性产生慢且与其他抗生素无交叉耐药反应,广谱而高效,被广泛用于兽医临床和畜牧生产,用于治疗动物疾病和作为饲料添加剂使用。但环丙沙星作为一种人畜共用药,药物残留通过食物链对人体危害极大,不利于将该类药物应用于人类疾病的治疗。美国、欧盟、中国等均对动物源性食品中环丙沙星残留限量做了禁用或限用的规定。为了监测畜产品中环丙沙星的残留,建立一种快速检测环丙沙星残留的方法具有十分重要的现实意义。ELISA凭借特异性强、灵敏度高、快速的优点,普遍应用于药物的残留检测。本研究运用化学合成方法制备CIP完全抗原,采用单克隆抗体技术制备了灵敏度高、特异性强、效价高的抗体,并建立CIP的CiELISA测定方法。鸡肝脏加标回收试验证明,建立的检测CIP残留的CiELISA是稳定、可靠的。1.CIP完全抗原的合成与鉴定采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)去和混合酸酐法将CIP与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)进行偶联,制备人工抗原CIP-BSA和CIP-OVA。通过紫外扫描初步判定两种完全抗原CIP-BSA和CIP-OVA偶联成功。2.CIP单抗的制备用NHS法合成的CIP-BSA为免疫原免疫BALB/c小鼠,混合酸酐法合成的CIP-OVA为检测原。五免后阳性血清效价为1：6,000左右。利用杂交瘤技术获得1株可持续分泌针对药物CIP抗体的杂交瘤细胞株6E4。采用体内诱生法,将细胞株6E4接种到小鼠体内,制备了抗CIP的腹水。其蛋白浓度为26.5mg/mL,腹水效价为1：24,000。3.ELISA检测方法的建立通过建立间接竞争ELISA方法,测定腹水最佳工作浓度在1：20,000。用6E4制备的腹水作出的CIP药物抑制标准曲线,其线性方程为Y=0.5611x-0.0748(R2=0.9904),IC50为10.58ng/mL,LOD低于2ng/mL,LOQ为5.32ng/mL。交叉实验表明,该单抗对CIP的抑制率为100%,对恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星的交叉反应率分别为34.6%、68.4%、13.4%,与其他非喹诺酮类抗生素链霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑无交叉反应。4.添加回收试验将建立的CiELISA初步应用于鸡肝添加回收试验。当鸡肝样品液作1.6倍以上稀释时,基本无基质干扰。在4～25ng/mL范围内,标准曲线方程为：Y=0.6515x-0.2937,R2=0.9918,ICso为16.53ng/g,LOD为4.01ng/g。用5、15、25ng/mL的环丙沙星标准液做添加回收试验,经检测环丙沙星回收率在77.8%-97.34%之间,批内差异在4.63%-16.74%之间,批间差异在8.57%-10.39%之间。