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目的探讨非选择性腺苷受体激动剂5’-N-乙基酰胺基腺苷(5,-(N-ethylcarboxamid-o)adenosine,NECA)对缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤心肌细胞的保护作用及其相关线粒体机制研究。方法利用H9c2心肌细胞系建立模拟I/R损伤模型,采用CCK-8细胞活性测定试剂盒检测细胞活性;通过线粒体膜电位检测试剂盒(Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)检测细胞线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,△Ψm);使用Amplex red过氧化氢/过氧化物酶试剂盒(Amplex red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit)测定细胞内H2O2水平,活性氧检测试剂盒(Reactive oxygen species assay kit with DCFH-DA)检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,Mitosox red线粒体超氧化物指示剂(Mitosox red mitochondrial superoxide indicator)检测线粒体内ROS水平;利用复合体I酶活性检测试剂盒(Complex I enzyme activity assay kit)检测线粒体呼吸链复合体I的活性。结果1.不同浓度NECA(0.1、1、10μmol/L)对I/R后心肌细胞活性具有不同程度的保护作用(均P<0.05),其中以1μmol/L时保护作用最为明显,因此我们使用该浓度进行后续实验;2.I/R后细胞活性明显降低,NECA可抑制I/R后细胞活性的下降,而腺苷A2A受体拮抗剂SCH58261、腺苷A2B受体拮抗剂MRS1706单独或联合使用均可阻断NECA对细胞的保护作用(均P<0.05),提示NECA通过激活腺苷A2A和A2B受体发挥其抗I/R损伤心肌保护作用;3.I/R后细胞JC-1红绿荧光强度比值明显降低,说明I/R导致△Ψm的显著降低,提示I/R导致线粒体通透性转换孔(Mitochondrial permeablity transition pore,m PTP)的开放。NECA可抑制I/R后细胞△Ψm的改变,而腺苷A2A和A2B受体拮抗剂单独或联合使用均可抑制NECA对△Ψm的保护作用(均P<0.05),提示NECA通过激活腺苷A2A和A2B受体而发挥其抗I/R损伤心肌保护作用,其机制可能与抑制I/R损伤引起的m PTP的开放有关;4.I/R损伤后细胞Amplex red、DCF、Mitosox red荧光强度均显著增强,说明I/R使细胞以及线粒体ROS的含量增加。NECA可抑制I/R后细胞内上述各荧光强度的增高,而腺苷A2A或A2B受体拮抗剂均可阻断NECA的作用(均P<0.05),提示NECA通过激活腺苷A2A和A2B受体来减少细胞及线粒体ROS的产生,进而发挥其心肌保护作用;5.NECA可降低I/R后线粒体复合体I的活性,而腺苷A2A或A2B受体拮抗剂均可逆转NECA对I/R损伤后细胞内线粒体复合体I活性的影响(均P<0.05),提示NECA激活腺苷A2A和A2B受体后产生的心肌保护作用可能与抑制线粒体复合体I的活性有关;6.Src酪氨酸激酶的选择性抑制剂PP2可抑制NECA对I/R损伤后细胞活性的保护作用(P<0.05),提示Src酪氨酸激酶可能介导NECA的心肌细胞保护;7.Src酪氨酸激酶的选择性抑制剂PP2可抑制NECA对I/R后细胞△Ψm的作用(P<0.05),提示NECA抑制m PTP开放的作用可能与Src酪氨酸激酶的激活有关;8.与NECA组相比,PP2+NECA组细胞Amplex red、DCF、Mitosox red荧光强度均显著增强(均P<0.05),提示NECA对I/R后细胞内以及线粒体ROS增高的抑制作用可能与Src酪氨酸激酶的激活有关。结论1.NECA通过激活腺苷A2A和A2B受体从而发挥抗I/R心肌保护作用;2.NECA可能通过抑制线粒体ROS的产生而抑制m PTP的开放并减轻I/R损伤;3.NECA可能通过降低再灌注期线粒体复合体I活性而抑制ROS的产生;4.Src酪氨酸激酶可能介导NECA的保护作用。