严重急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)又称传染性非典型肺炎,是由一种人类从未发现过的新型冠状病毒所导致的、严重危害公共卫生安全的疾病。WHO已将该病原体命名为SARS冠状病毒(SARS Coronavirus,SARS-CoV)。该病突出特点是来势凶猛、可爆发流行、传染性强、死亡率较高。目前虽然在全球范围内已完全控制了该病,但由于对其认识不深,并不能排除其再度爆发的可能性,因此很有必要继续深入探索防治SARS的方法。迄今为止,没有治疗SARS的特效药,主要依靠对症支持疗法和中西医结合疗法。临床上应用糖皮质激素曾取得较好疗效,但其使用的时机、剂量和持续时间仍是争论的焦点,因为一旦使用不当,可能会抑制机体的抗病毒免疫应答,不利于病毒清除,而且毒副作用很大。抗病毒药物方面,使用最多的是利巴韦林,但缺乏对照研究,体外抗病毒试验也未发现其有抗冠状病毒活性,所以作用尚待进一步明确。使用恢复期SARS患者血清治疗虽说有效,但应用的对象太局限,且危险性和风险性大,故限制了其临床应用。另外,中西医结合治疗虽也取得了积极的疗效,但作用机制无法明确。理论上,控制SARS理想的方法首选是接种疫苗,但是一种安全、有效的疫苗研制周期很长,到目前为止仍然没有对人起保护作用的疫苗可利用。现在,研究其他治疗SARS的新方法正在进行,其中,RNA干扰(RNA interference,RNAi)可能非常有希望成为一种潜在的控制SARS病毒的方法之一。RNA干扰是一种由双链RNA介导的转录后基因沉默机制,当外源导入的dsRNA被Dicer酶切割成19～23nt的小分子干扰RNAs(siRNAs)后,siRNAs就与体内其他成分聚合形成RNA诱导的基因沉默复合体(RISC),然后活化的RISC通过由siRNA决定的碱基配对原理来切割具有同源序列的转录体,最终导致特异的基因沉默效应。RNAi技术发展十分迅速,不仅已成为研究基因功能的有力工具,还正在被用于人类疾病基因治疗的实验研究中。除了将RNAi运用于抑制肿瘤外,在由病毒介导的感染病研究领域,利用RNAi技术来特异的抑制HIV、HCV、HBV和流感病毒的复制及蛋白表达都取得了初步成功。这些都为本课题研究RNAi抑制SARS病毒复制与感染提供了理论依据。 本研究受中国国家重点基础研究发展规划资助项目(“973”项目): SARS防治基础研究(2003CB514108)的资助。<WP=10>因此,根据SARS-CoV的全长基因信息和pSilencer 3.1-H1载体的使用说明书,我们设计、选择了分别针对SARS病毒的Leader、Nsp4和RdRp基因的4个siRNA靶序列,随后合成了相应的8条寡核苷酸,再将两两互补的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pSilencer 3.1-H1载体上,构建了表达siRNA的4种质粒;同时,分别扩增出SARS的Leader和Nsp4基因,并将其分别克隆到pEGFP-N1载体上,形成表达Leader+EGFP和Nsp4+EGFP两种融合蛋白的重组质粒;然后在HeLa细胞中,使用FACS和RT-PCR方法分别从蛋白和mRNA水平观察这4种siRNA质粒产生的RNA干扰效应对其相应的靶基因是否有特异性;最后在P3实验室,通过细胞病变试验、病毒空斑形成和MTT试验来评价RNA干扰对SARS-CoV的最终效应。结果显示,本研究设计的siRNA序列克隆到了pSilencer 3.1-H1上相应位置,序列正确;分别编码Leader+EGFP和Nsp4+EGFP两种融合蛋白的重组质粒被成功构建;转染细胞,通过倒置荧光显微镜可看见胞内有绿色荧光,证实了pEGFP-Leader和pEGFP-Nsp4两种质粒表达目的基因的有效性;共转染后,FACS分析确定了表达siRNA的质粒产生的RNAi效应对其相应靶基因表达的蛋白具有特异性的抑制作用,RT-PCR分析则从mRNA水平确定了该RNAi效应对靶基因的特异性抑制;细胞病变试验和MTT试验证实表达siRNA质粒介导的、针对SARS病毒的RNAi效应对Vero E6细胞具有明显的保护免受病毒感染的作用;病毒空斑形成试验证明这种RNAi效应对病毒的复制有直接、明显的抑制作用。综上结果,本研究证实了质粒介导型siRNA所产生的RNAi效应对SARS病毒Leader和Nsp4基因的表达有特异性的干扰,对SARS病毒的复制与感染有明显的抑制作用,为利用RNAi技术来防治SARS提供了实验证据。