糖酰胺酶(glycoamidase,EC 3.5.1.52),全称为peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase(PNGase),水解糖肽或糖蛋白 N-连接糖链的 N-乙酰氨基葡萄糖与天冬酰胺残基之间的酰胺键,释放出完整的寡糖链。真核细胞生物体内,尤其是在细胞质内质网周围广泛存在PNGase,其具有区分天然或变性糖蛋白的特性,与蛋白酶复合体依赖的蛋白降解系统协同作用,实现对细胞质中来自内质网合成的错误折叠糖蛋白的去糖基化处理。在已鉴定出的真核生物PNGase同源蛋白中,经序列分析显示存在由Cys,His和Asp组成的催化三联体,此催化三联体为转谷氨酰胺酶样超家族中的成员所共享,其成员表现出不同的生化活性,包括转谷氨酰胺酶、蛋白酶和PNGase等。所有这些催化活性都涉及酰胺键的形成或水解。作为真核PNGase的典型代表,酿酒酵母PNGase(yPnglp)研究最为透彻,研究者对其结构、功能、与其他蛋白关联等进行了深入研究,还有研究者进行了大肠杆菌重组表达和包涵体复性得到具有体外活性的重组yPnglp。同时有研究者发现来自于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的糖酰胺酶(AtPng1p)不能在大肠杆菌中可溶性表达,包涵体复性后显示转谷氨酰胺酶活性。但也有研究显示AtPng1p可以补偿酵母中yPng1p敲除的影响,暗示其具有PNGase活性,与上述研究结果矛盾。针对AtPng1p相互矛盾的研究报道,为深入研究真核生物PNGase,我们尝试通过使用不同表达载体、优化密码子、目标蛋白与内含肽共表达等多种策略,最后在大肠杆菌中实现了该蛋白的可溶性表达。以变性RNaseB为底物,成功验证了 AtPng1p的去糖基化活性,并对其反应最适条件因素,包括温度、pH值、缓冲液等进行了探索。另外,我们没有发现重组AtPng1p具有转谷氨酰胺酶活性的显著证据,进一步证明AtPng1p体内和体外的活性应该是PNGase。前人使用大肠杆菌表达酵母yPng1p形成包涵体,复性后的yPng1p表现PNGase活性,具有良好的应用前景;但是没能获得可溶性表达,复性操作复杂产率低。我们借鉴AtPng1p重组表达策略,实现了 yPng1p和另一种低等植物莱茵绿藻来源的PNGase的大肠杆菌可溶性表达,验证了它们的去糖基化活性。论文探索出的PNGase可溶性表达策略具有较好适应性,将有力促进真核生物PNGase的生化性质研究及在蛋白糖链分析中应用开发。