目的：本实验为课题―雷公藤甲素对同种异体软骨细胞移植免疫排斥反应作用的实验研究‖的前期实验,目的是通过研究兔关节软骨细胞体外二维及三维培养环境中增殖及代谢情况,为下一步动物实验筛选出最合适的种子细胞及回植体内修复关节软骨缺损的最佳时间点。 　　方法：取2周龄青紫蓝兔,耳缘静脉空气栓塞处死,立即刮除两侧髋、膝关节周围兔毛,采用无菌手术方式切取两侧股骨头和股骨髁,随即浸泡于 PBS液中,并移至超净台,分离软骨,用消毒好的剪刀将其剪碎, II 型胶原酶消化获取软骨细胞；体外单层培养(不使用任何生长因子),长满后传代,倒置显微镜下观察第1 代至第 5 代细胞形态的变化；样品细胞进行台盼蓝染色,计数未着色细胞,求平均值,绘制每代细胞的生长曲线,判断细胞的增殖能力；逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：以青紫蓝兔半月板来源的纤维软骨细胞分别作为阳性对照和阴性对照,检测各代细胞 I 型胶原和Ⅱ 型胶原在基因水平的表达；三维环境下,采用Hoechst33258 DNA定量法测定细胞在PLGA中的生长增殖情况；GAG定量检测来判断软骨细胞在支架材料上增殖和分化能力。 　　结果：贴壁的原代软骨细胞呈椭圆形、多角形、多边形,随着培养时间的延长,软骨细胞形态发生明显改变,至第4代,细胞由多角形逐渐向梭形转变,即向成纤维细胞样转化；至第5代,细胞以梭形为主,细胞间间隙增大,胞质不清,内可见空泡。细胞的增殖能力随着传代次数的增加而逐渐减小,秩和检验分析发现：原代及第1、2代细胞与第3、4代细胞生长曲线间有差异( P﹤0.05),与第5代细胞存在显著性差异(P﹤0.01)。RT-PCR：在 I型胶原的检测中,第 3代细胞的条带亮度与第1、2代相比,明显较强,而第 4代细胞的亮度和阳性对照几乎一样；在Ⅱ型胶原的检测中,第4代细胞的条带亮度较前3代明显较暗。倒置显微镜下观察软骨细胞接种PLGA支架材料上1天后的情况,显示出二者粘附性较好；应用Hoechst33258 DNA定量法测定细胞在PLGA中的生长增殖情况显示：在接种以后,细胞即显示出较强的增殖能力,并维持 1 周左右,到第 10 天时趋于稳定,第 14 天达到最高峰,而后少许回落,但与峰值相比无显著性差异。随着培养时间的延长,单位 DNA 产生 GAG 的量呈增加的趋势,尤其是前两周其增加幅度逐渐加大,至第17天达到峰值。 　　结论：单层培养环境中,软骨细胞从第3代已经发生去分化,开始表达纤维软骨的 I型胶原,提示第 3代及其以后的细胞不适合做为种子细胞。第2代细胞既有很强的增殖能力,又保持了软骨细胞的特异性表型,为最合适的种子细胞来源。三维培养环境中,兔关节软骨细胞与 PLGA 复合物体外培养 14 天时,细胞数量达到峰值,17天时单位细胞的 GAG含量最高,因此,我们将植入体内的时间设定为第14~17天。