论文部分内容阅读
癌症即恶性肿瘤,是由控制细胞生长增殖机制失常而引起的的疾病。它与心脑血管疾病、糖尿病并称为危害人类健康的三大杀手。肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,据美国癌症协会统计,肝癌的死亡率逐年增加,而存活率仅为18%。目前癌症的治疗手段有手术切除、化疗、放疗、基因治疗、免疫治疗、物理治疗、传统中药治疗等。其中以手术切除、化疗、放疗为主,其他治疗手段也在迅速发展。基因药物具有强的靶向性、低毒性、低使用剂量、能够自动降解等优点,在疾病治疗中表现出巨大的优势。然而其稳定性差、易降解、半衰期短、转染效率低等缺点限制了其进一步发展。目前上市的基因药物较少,且以病毒性载体为主,病毒载体转染效率高,但存在免疫原性、致癌性以及病毒DNA插入宿主细胞整合等弊端。非病毒载体虽具有很多优势,但其转染效率明显低于病毒性载体。为了解决siRNA自身缺点、非病毒载体存在的问题及各种生物屏障,需要构建有效的转运体系,将基因转运到靶器官或者靶细胞,实现靶向基因治疗。近年来,石墨烯纳米材料的迅速发展为我们的工作提供了新的思路,其独特的理化性质使其在生物医药领域表现出巨大的潜力。以石墨烯纳米材料为载体构建安全有效的转运体系以实现基因治疗的研究越来越深入,其克服了基因自身存在的弊端,可实现从基因根源治疗疾病的目的。SiRNA在序列特异性降解和mRNA转录抑制方面具有很大的潜力,得到了广泛的研究与应用。血管生成因子A(VEGFa)是一种重要的血管生成调节介质且在多种肿瘤组织中过表达,因此,我们选用anti-VEGFa siRNA做为工具药物,用于肝癌的基因治疗。为了解决siRNA稳定性差、易降解、半衰期短、转染效率低等缺点,并结合氧化石墨烯的性质,我们设计构建了甘草次酸(GA)、聚乙二醇(PEG)和聚酰胺树突状大分子(PAMAMDendrimer)修饰的新型氧化石墨烯纳米载体 GA-PEG-NGO-Dendrimer(GPND)递送 anti-VEGFa siRNA(GPND/anti-VEGFasiRNA),我们对其做了详细的结构表征及理化性质研究,并通过生物实验来评价纳米复合物的体内外活性。我们采用改良的Gabriel合成法制备双氨基聚乙二醇PEG-NH2,将PAMAM Dendrimer及合成的GA-PEG通过共价键连方式接到氧化石墨烯表面得到GPND,其结构通过核磁共振氢谱、红外光谱、MALDI-TOF/TOF质谱、元素分析等手段确证。理化性质研究结果表明,与氧化石墨烯纳米材料(NGO)相比,功能化的GPND的粒径和厚度均有所增加,zeta电位由负值变成了正值。修饰后的GPND在生理条件下的稳定性显著提高。比起NGO的迅速沉淀,功能化的GPND能在生理盐水、磷酸缓冲液以及含10%胎牛血清的培养基中稳定存在。另外,GPND具有良好的生物相容性,即使在250μg/mL的高浓度下,溶血率低于2%。我们首先评价GPND/siRNA纳米复合物的体外活性。研究表明,修饰后的GPND的毒性大大降低,即使在100mg/L的高浓度时,细胞存活率超过了 80%,证明制备的纳米载体GPND具有较高的安全性。我们通过细胞成像和流式细胞术实验定性和定量地评价了 GPND/siRNA纳米复合物的细胞摄取情况,证明GPND能够显著提高siRNA的转染效率,且转染效率明显高于传统转染试剂Lipofectamine 2000,改善了 siRNA转染效率低的缺点。另外,研究发现GPND能够保护siRNA不被RNase降解。我们进一步采用QPCR和western blot实验从mRNA和蛋白水平评价GPND/anti-VEGFa siRNA纳米复合物对HepG2细胞内VEGFa表达的影响。结果表明,给药后,HepG2细胞中VEGFa基因在mRNA及蛋白水平的表达均显著降低,证明进入细胞的GPND/siRNA能够实现溶酶体的逃逸和siRNA的有效释放。以上实验证明,在体外,GPND能够克服多种细胞屏障和siRNA的自身缺点,将siRNA有效地转运到肝癌细胞,实现目的基因VEGFa的表达抑制。我们以裸鼠作为动物模型,通过体内实验进一步验证GPND/siRNA纳米复合物的体内活性。研究表明,GPND具有很强的靶向性,能够保护siRNA不被体内RNase降解,高效递送siRNA到裸鼠肝肿瘤组织,改善了 siRNA稳定性差、易降解、半衰期短的缺点,从而能够实现目的基因的表达抑制,实现肝肿瘤组织的生长抑制。组织病理学研究表明,生理盐水、siRNA及GPND/siRNA纳米复合物三个给药组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾无明显差异,均无明显的病理变化,初步证明GPND具有较高的体内安全性。综上所述,GPND是极具潜力的基因载体,具有潜在的临床应用前景,对非病毒载体的基因治疗提供了一定的理论基础和实验依据,具有理论意义和应用价值。本课题研究构建的GPND是一个多功能的转运体系,能够通过改变靶向因子实现不同的靶向性。另外,该运载体系不仅能够转运基因,还可以转运药物、光敏感剂以及其他治疗分子,并且有望实现多种治疗手段协同作用的联合治疗。