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本实验室前期研究发现Variovorax boronicumulans CGMCC 4969可将噻虫啉(THI)的氰基水解生成酰胺噻虫啉(THI amide)。V. boronicumulans CGMCC 4969的腈水合酶(TNHase)包括三个开放阅读框(TnhA.TnhB和TnhC)。在Escherichia coli BL21重组表达了TNHase的α和β亚基(TnhA和TnhB),但存在包涵体严重、活性较低等问题。本文研究了TnhC的共表达对TNHase表达水平和生物活性的影响,并进一步优化了TNHase的表达和转化条件。本文将TnhA、TnhB和TnhC基因连接到表达载体pET28a上,分别在E. coli BL21(DE3) plysS和E. coli Rosetta (DE3) plysS中进行诱导表达,实验结果显示TNHase在Rosetta中表达时,活性高于在BL21中表达。利用Rosetta作为宿主,将TnhA、TnhB和TnhC基因和来自pET28a质粒的SD序列按照不同的组合和顺序进行诱导表达,结果表明TnhAB与TnhC的顺序及SD序列的有无对TNHase的异源重组表达水平有重要影响。当仅表达TnhAB时,重组蛋白主要以包涵体形式存在；当TnhC位于TnhAB后时,TnhC的表达量少,TnhAB的可溶性没有改善；当TnhC位于TnhAB前时,TnhC表达量很大,且可溶性较好,但TnhA和TnhB的表达量较低；当TnhC位于TnhAB前并在其之间引入一段SD序列时,TnhA、TnhB和TnhC表达量均较高,并均以可溶性蛋白的形式存在。静息转化实验表明pNABC、pNAB、pNCAB和pNCDAB四种质粒的诱导表达菌株降解THI的半衰期分别为4.0,99.0,59.2和13.4min。当TnhC位于TnhAB后共表达时,虽然无法改善重组蛋白的表达水平,但TNHase转化THI的能力较仅表达TnhAB时提高了14.8倍；而当TnhC位于TnhAB前共表达时,由于TnhA和TnhB的表达量较低,TNHa se转化THI的能力降低了0.4倍；当TnhC位于TnhA B前并在其之间引入一段SD序列时,虽然显著改善了重组蛋白的可溶性,但TNHase转化THI的能力仅提高了4.4倍。本文进一步优化了TNHase的表达和静息转化条件。实验结果表明重组表达的TNHase静息转化THI的最优条件是pH为7.0-8.0、温度为25-35℃、Co2+的浓度为0.2-0.3 mmol/L。上述重组菌株的TNHase具有将3-氰基吡啶转化为烟酰胺的能力,实验结果同样显示TNHase在Rosetta中表达时,重组酶转化3-氰基吡啶的活性高于在BL21中表达,同时TnhAB和TnhC的共表达同样可提高该活性。静息转化3-氰基吡啶时,TNHase的最优表达条件为,Rosetta-pNABC在含有0.2mmol/L的Co2+的培养基中培养到OD600为0.7时加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导表达；TNHase的最优静息转化条件为pH为7.0、温度为25℃。本文的实验结果证明TnhC的共表达可以明显的改善TNHase的表达水平,并显著提高重组表达的TNHase静息转化THI的活性。同时本文还优化了’rNHase的表达和静息转化3-氰基吡啶的条件。