论文部分内容阅读
【目的】众所周知,高程度胶质瘤是成人中最常见和最恶性的原发性脑肿瘤。其中,IV级胶质瘤,也称为胶质母细胞瘤(GBM)表现为破坏性的临床进展,生存期短以及生活质量差。替莫唑胺(TMZ)是胶质母细胞瘤最成功的化疗药物,但是许多GBM患者对基于TMZ的化疗没有反应。miRNA通过调控靶基因,参与各种生物学的过程,包括细胞分化,增殖,细胞迁移,侵袭,自噬等。在包括胶质母细胞瘤在内的许多肿瘤中都观察到miRNA的失调。据报道,一些特异性的miRNA在GBM中失调,参与调节化疗或放疗抵抗。但是,miR-505在GBM肿瘤发生和化疗敏感性方面的作用尚未见报道。因此,本研究旨在探讨miR-505对GBM发生和进展的影响及其发挥作用的分子机制,找到一种新的miRNA可以促进GBM对TMZ的敏感性,从而开发对GBM有效的治疗策略。【方法】首先,我们通过RT-qPCR实验检测了不同程度GBM患者组织和正常脑组织中miR-505的表达水平,不同GBM细胞系中miR-505的表达水平,以及TMZ处理对miR-505表达水平的影响。通过Kaplan-Meier生存曲线分析了miR-505表达水平不同的GBM患者的生存率。其次,我们进行CKK-8、集落形成、Ed U实验,细胞周期、细胞凋亡、Western blot实验和Transwell迁移实验检测了miR-505对GBM细胞增殖和迁移的影响。然后,我们通过生物信息学软件预测miR-505的候选靶基因,通过EGFP荧光报告载体实验、RT-q PCR和Western blot实验验证miR-505对WNT7B的靶定作用。通过RT-q PCR实验检测了不同程度GBM患者组织和正常脑组织中WNT7B的表达水平,通过Pearson相关分析进一步验证组织水平miR-505和WNT7B的相关性。接下来,我们通过RT-q PCR实验、Western blot实验、CKK-8实验、集落形成实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验和Transwell迁移实验检测了不同GBM细胞系中WNT7B的表达水平以及WNT7B对GBM细胞增殖和迁移的影响,并通过功能挽救实验验证miR-505的生物学功能是否通过其对WNT7B的调控实现。最后,我们通过细胞免疫荧光实验、Western blot实验和Top-Flash/Fop-Flash双荧光素酶报告基因实验检测miR-505对Wnt/β-catenin信号通路活性及其下游分子的影响。通过肿瘤异种移植模型、Western blot实验和免疫组织化学染色实验研究了miR-505及WNT7B对GBM肿瘤体内生长的影响。【结果】miR-505的表达水平与GBM的恶性程度呈负相关,且TMZ能促进GBM中miR-505的表达。miR-505通过抑制细胞从G0/G1期向S期转换,促进细胞凋亡抑制GBM细胞的活性和增殖。miR-505通过抑制细胞发生EMT转化抑制GBM细胞的迁移,TMZ与pri-miR-505联合处理后,miR-505的抑癌作用增强。miR-505直接靶定WNT7B,并在m RNA和蛋白水平下调WNT7B的表达。此外,在组织水平miR-505与WNT7B的表达负相关。WNT7B通过加速细胞周期进程,抑制细胞凋亡对GBM细胞的生长活性和增殖起促进作用。WNT7B通过促进EMT途径,进而促进GBM细胞的迁移。同时,功能挽救实验也证实了WNT7B是miR-505的功能性靶基因,miR-505对GBM细胞恶性表型的抑制作用是由WNT7B介导的。miR-505通过下调WNT7B的表达,抑制β-catenin入核,从而抑制Wnt信号通路下游效应分子的表达,灭活Wnt/β-catenin信号通路。miR-505在体内抑制GBM肿瘤细胞的生长和增殖,其机制为抑制WNT7B、β-catenin的表达从而抑制Wnt/β-catenin通路及其下游。【结论】miR-505在胶质母细胞瘤中作为肿瘤抑制剂抑制肿瘤发生。此外,TMZ可以提高miR-505的表达水平,并能够与miR-505结合促进GBM细胞中miR-505介导的抑制作用。而且,miR-505直接靶定并抑制WNT7B,从而使Wnt/β-catenin通路失活。总之,诱导miR-505结合TMZ治疗可能是抑制GBM的有用治疗策略。