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[目的]:
探讨研究microRNAlet-7a是否对食管鳞癌中IL-6表达具有调控作用。
[方法]:
分别通过体内实验和体外实验进行探讨论证。(1)体内实验部分:采用茎环结构的逆转录实时定量PCR法检测40例食管鳞癌组织及相对应的癌旁正常组织中let-7a的表达情况;实时荧光定量PCR法,免疫组化SP法检测IL-6的表达情况。并采用Pearson相关分析及x2检验分析食管鳞癌患者体内let-7a和IL-6mRNA、蛋白表达水平之间的相关性。(2)体外实验部分:应用microRNA转染技术,将let-7a模拟物、模拟物阴性对照、let-7a抑制剂、抑制剂阴性对照分别转染入人食管鳞癌细胞系TE-1和Eca-109;利用茎环结构的逆转录实时定量PCR、实时荧光定量PCR方法分别检测转染各组细胞内let-7a及IL-6mRNA的表达变化,ELISA及Westernblot法检测转染各组细胞内IL-6蛋白的表达变化。
[结果]:
(1)40例食管鳞癌组织中,let-7amRNA在食管鳞癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织(P<0.01);IL-6mRNA在食管鳞癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织(P<0.01);免疫组化结果显示IL-6蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁正常组织(P<0.01)。
(2)相关性分析显示let-7a和IL-6的mRNA在食管鳞癌组织中的表达存在负相关关系(r=-0.974;P<0.01);此外IL-6蛋白阳性表达组的let-7a的表达量低于IL-6阴性组(P<0.05)。
(3)在转染let-7a模拟物的TE-1细胞中let-7a的表达量是未转染前的3.53倍(P<0.01),同样在转染let-7a模拟物的Eca-109细胞中let-7a的表达量是未转染前的3.17倍(P<0.01);而在转染let-7a抑制剂的TE-1细胞中let-7a的表达水平下降为未转染前的0.72倍(P<0.01),同样在转染let-7a抑制剂的Eca-109细胞中let-7a的表达量下降为未转染前的0.18倍(P<0.01)。
(4)ELISA结果显示:在转染let-7a模拟物的TE-1和Eca-109细胞中IL-6的分泌显著减少;westernblot结果显示:在转染let-7a模拟物的TE-1细胞中IL-6蛋白表达水平下降为未转染前的0.55倍(P<0.05),在转染let-7a模拟物的Eca-109细胞中IL-6蛋白表达水平下降为未转染前的0.53倍(P<0.05),在转染let-7a抑制剂的TE-1细胞中IL-6蛋白表达水平上升为未转染前的1.88倍(P<0.05),在转染let-7a抑制剂的Eca-109细胞中IL-6蛋白表达水平上升为未转染前的1.90倍(P<0.05);然而qRT-PCR结果显示各组转染细胞中IL-6mRNA水平无明显变化(P>0.05)。
[结论]:
(1)本研究通过组织水平检测分析,发现食管鳞癌组织中let-7a表达下调,IL-6表达上调且两者显著负相关,提示可能表达下调的let-7a丧失了对靶基因IL-6的抑制。
(2)本研究通过体外试验,发现在转染的食管癌TE-1和Eca-109细胞中let-7a能抑制IL-6的蛋白表达水平,但IL-6mRNA水平未受影响,提示let-7a可能在转录后水平调控IL-6蛋白的表达,let-7a可能通过调控IL-6的表达来介导食管肿瘤的发生。