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附睾上皮细胞（Epididymis epithelial cells,EECs）形成的附睾腔微环境对维持精子的正常成熟起着关键作用,活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）是细胞氧化还原代谢的副产物,附睾中适量的ROS通过调节c AMP水平在精子成熟和获能的生理过程中起重要作用,而过量的ROS会使精子受到氧化应激的损伤,因此,维持附睾腔微环境的氧化还原平衡对于精子成熟具有主要的作用。谷胱甘肽过氧化物酶5（Glutathione Peroxidase 5,GPX5）在附睾中高表达,目前,没有关于绵羊EECs中GPX5功能及其调节的研究报道。因此,本实验在优化绵羊附睾上皮细胞体外培养条件的基础上,研究了雄激素对绵羊附睾上皮细胞中GPX5功能的调节机制,研究结果如下:1.EGF对绵羊EECs体外增殖的影响。采用CCK-8法测定细胞生长情况,RT-PCR检测EECs中功能标记基因GPX5和AR表达,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,Western blot检测细胞中EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平。结果显示50 ng/m L EGF可以显著促进EECs的增殖,且不同代EECs细胞均可正常表达GPX5和AR基因;EGF极显著提高了处于S期的细胞比例（P<0.01）,显著降低了细胞凋亡指数（P<0.05）。与对照组相比,EGFR抑制剂Gefitinib的添加极显著降低了处于S期的细胞比例（P<0.01）,凋亡指数极显著升高（P<0.01）;PI3K/AKT抑制剂LY294002的添加显著降低处于S期的细胞比例（P<0.05）,但凋亡指数无显著变化（P>0.05）。与对照组相比,EGF可以极显著提高EECs细胞的EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平（P<0.01）;与EGF组相比,EGF+Gefitinib组EECs中EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平极显著降低（P<0.01）,而EGF+LY294002组EECs的AKT和FOXO1磷酸化水平呈极显著降低（P<0.01）。2.海藻糖对绵羊EECs体外增殖的作用。利用酶标仪检测EECs增殖情况,RT-PCR检测不同传代的EECs功能标记,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,DCFH-DA检测细胞内ROS水平,酶化学法检测细胞内抗氧化剂水平,q RT-PCR和ELISA检测细胞GPX5的表达。结果表明:100 mmol/L海藻糖有效地提高EECs的生长能力,极显著增加处于S期细胞比例（P<0.01）,并极显著降低凋亡率（P<0.01）;100 mmol/L海藻糖培养的EECs在体外可连续传代14次,而且标记基因GPX5和AR正常表达。与对照组相比,100 mmol/L海藻糖处理的细胞ROS极显著降低（P<0.01）,CAT和GPXs活性分别呈极显著（P<0.01）和显著（P<0.05）升高,GPX5的m RNA和蛋白表达分别表现出极显著（P<0.01）和显著（P<0.05）上调。3.绵羊EECs中GPX5的抗氧化作用。采用si RNA干扰绵羊EECs的GPX5基因表达,分为si RNA-GPX5、si RNA-NC转染对照组和对照组,采用CCK-8检测细胞增殖,DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平,采用TBA法检测细胞内MDA含量,免疫荧光检测细胞内8-OHd G水平,q RT-PCR检测EECs中主要的抗氧化基因的m RNA表达量。结果表明:随着H2O2处理浓度的增加,与对照组相比,si RNA-GPX5组的增殖能力不断下降。与对照组相比,si RNA-GPX5细胞中的ROS含量和MDA产生量分别呈极显著（P<0.01）和显著（P<0.05）的升高,si RNA-GPX5细胞中的8-OHd G水平明显的增多。si RNA-GPX5+T组细胞中GPX1和GPX3的m RNA表达量较si RNA-GPX5处理组有显著的升高（P<0.05）,SOD和GPX4的m RNA表达量比si RNA-GPX5处理组有极显著的升高（P<0.01）。4.睾酮、AR及其共调节因子对绵羊EECs中GPX5的调节作用。采用CCK-8检测不同浓度睾酮处理的EECs增殖情况,q RT-PCR检测GPX5、AR、SRC-1、CBP、p300、NCOR2 m RNA表达量,免疫荧光法和Western Blot法检测GPX5、AR、SRC-1、CBP、p300、NCOR2的表达量,双荧光素酶报告基因检测AR与GPX5基因的结合作用、结合位点以及AR转录活性。结果表明,外源性睾酮对EECs的增殖呈现浓度依赖性,其中,100 nmol/L睾酮组的细胞生长最好。100 nmol/L睾酮组的细胞GPX5m RNA和蛋白表达量极显著高于对照组（P<0.01）,而1 000 nmol/L睾酮组细胞GPX5 m RNA和蛋白表达量与对照组差异不显著（P>0.05）,却分别极显著（P<0.01）和显著（P<0.05）低于100 nmol/L睾酮组。与对照组相比,100 nmol/L睾酮组AR在细胞核中的表达明显增多（P<0.05）,AR m RNA和蛋白表达量分别呈极显著（P<0.01）和显著（P<0.05）的提高;然而1 000 nmol/L睾酮组细胞AR m RNA和蛋白的表达量显著低于对照组（P<0.05）。1 000 nmol/L睾酮组细胞CBP、p300、SRC-1蛋白表达呈现极显著增高（P<0.01）,特别是核内的表达量增高明显。si RNA-AR组细胞GPX5 m RNA和蛋白的表达量与对照组差异不显著（P>0.05）。pc DNA3.1-AR组GPX5 m RNA和蛋白表达量较对照组呈极显著（P<0.01）和显著（P<0.05）升高。p GL3-GPX5-pro-wt+pc DNA3.1-AR组的荧光素酶活性显著高于p GL3-GPX5-pro-wt+pc DNA3.1组（P<0.05）,与p GL3-GPX5-pro-wt相比,p GL3-GPX5-pro-mut1组荧光素酶活性显著下调（P<0.05）。si RNA-AR组细胞SRC-1和p300蛋白表达量极显著高于对照组（P<0.01）。si RNA-SRC-1组细胞GPX5 m RNA和蛋白表达量较对照组显著的降低（P<0.05）,si RNA-p300组细胞GPX5的m RNA和蛋白的表达量均显著低于对照组（P<0.05）。si RNA-SRC-1和si RNA-p300组细胞AR蛋白表达量与对照组差异不显著（P>0.05）,si RNA-SRC-1和si RNA-p300组的细胞AR的转录活性显著降低（P<0.05）。综上所述,EGF通过EGFR/PI3K/AKT通路上调FOXO1的磷酸化增强绵羊EECs体外生长能力。海藻糖通过增加CAT、GPXs的酶活性和GPX5的表达量发挥抗氧化活性以促进EECs的体外增殖。GPX5可以有效地保护绵羊EECs免受脂质过氧化损伤及DNA的氧化损伤。睾酮对绵羊EECs GPX5、AR及其共调节因子的表达具有浓度依赖性的调节效应,睾酮通过AR及其共调节因子SRC-1和p300/CBP调节GPX5表达,AR以靶向结合的方式促进GPX5转录。SRC-1和p300/CBP可以提高AR转录活性,在AR表达明显降低时维持靶基因GPX5的表达量。