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目的：利用恒定浓度顺铂、周期性作用的方法，建立人口腔腺样囊性癌耐顺铂细胞株，并观察细胞形态的变化。检测新产生的耐顺铂细胞株SACC／DDP对四种常用化疗药物的抗性，并评价其多药耐药性；检测细胞株中MRP蛋白表达的变化，探讨SACC／DDP细胞株获得多药耐药的机制。 方法：1、人口腔腺样囊性癌SACC细胞株培养由四川大学华西医学中心提供。利用浓度为1ug／ml顺铂作用于该细胞，时间48小时，每月换药一次，经过6个月的诱导形成生长良好的耐药细胞株SACC／DDP。采用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化并摄片记录，检测SACC和SACC／DDP细胞株群体倍增时间的变化，并绘制生长曲线。用MTT法测定体外诱导的SACC／DDP细胞在脱离DDP作用6个月及12个月后的抗药保持性。2、采用不同剂量的甲氨喋呤、平阳霉素、长春新碱、丝裂霉素四种化疗药物作用于SACC和SACC／DDP细胞株，利用MTT法、流式细胞仪和AO荧光染色法检测化疗药物对两种细胞的杀伤效应、以及对细胞周期、凋亡易感性的影响。利用免疫组化SP法检测细胞内促凋蛋白Bax的表达。3、运用免疫组化、Western-blot法检测SACC和SACC／DDP细胞株中MRP蛋白的表达，RT-PCR检测人口腔癌细胞SACC和SACC／DDP的MRP mRNA的表达，HPLC法检测细胞内化疗药物浓度的变化。 结果：1.1、SACC细胞株为贴附型生长方式的细胞，具有上皮细胞的典型特征：扁平多角形，胞质中央有圆形细胞核，细胞间紧密相靠，相互衔接，具有连接成片的能力。在恒定顺铂药物浓度、周期性作用方式的诱导下，经过6个月时间，形成了在lug／ml顺铂浓度下生长稳定的SACC细胞株。在诱导过程中发现细胞的形态发生了变化，表现为细胞内颗粒及空泡增多，细胞大小不一，呈圆形、三角形或多角形，细胞外形多样化、核大、偏心位、染色质粗大，胞浆丰富等。1.2、计算SACC和SACC／DDP人口腔腺样囊性癌细胞的群体倍增时间分别为TdSACC=40.2（小时）和TdSACC/DOP=61.9（小时）。可见，SACC／DDP细胞株的群体倍增时间较SACC人口腔腺样囊性癌细胞明显延长（P＜0.05）。1.3、培养形成的SACC／DDP细胞对顺铂的抗药指数为RF=15.08，表明SACC／DDP对DDP的耐药性明显增强。脱离培养6个月，抗药指数RF=12.37，脱离培养第三军医人学硕士学位论文12个月，抗药指数RF二10.28。脱离培养6个月及12个月，SACC/DOP细胞对DDP的抗药保持性分别为82%和68%。2.1、VCR、MTX、PYM、姗C四种化疗药物对体外生长的SAcC细胞株均有明显的细胞毒效应，而采用OD尸诱导后获得的SACC/DDP细胞株，均对上述四种药物产生了不同程度的耐药性。2.2、SACC/DDP细胞与亲代的SACC细胞比较，细胞周期出现显著变化，G。/G:期细胞比例下降，而GZ/M期比例上升，并与化疗药物浓度密切相关。艺.3、指数期生长的5八CC细胞存在一定的祠亡率，并在与化疗药物孵育后出现了典型的凋亡表现:细胞空泡样变化、细胞核碎裂和新月体形成.其凋亡率随化疗药物的浓度增高而增加。而对于SACC/DDP细胞，其被化疗药物诱导的凋亡率呈现出显著下降趋势，在多组浓度的药物中与亲代细胞呈现显著差异。体外培养的S人CC细胞中促凋蛋白Bax表达率高，阳性率为66.2%。经过诱导产生的SACC/DDP细胞株中Bax的表达呈现明显下降，阳性率为20.7%，与亲代细胞相差显著（P<0 .01）.3.1、免疫组化结果显示:体外培养的SACC口腔癌细胞株MRP蛋白的表达率低，阳性率仅为23.魂%。而ODP诱导产生的耐药细胞株SACC/DDP的MRP阳性表达率为84.2%。3.2、Western一blot法检测结果显示:体外培养的SACC细胞株MRP蛋白的表达水平较低，仅为18.04士8.27;而SACC/DDP细胞的MRP表达水平显著升高，为74.70士17.56 （P<0.01），与SW1990胰腺癌细胞的表达水平86.52士20.11较为相近。3.3、SACC口腔癌细胞株表达MRP mRNA的水平偏低，仅为0.212士0.101，而经DDP诱导后，SACC/DDP细胞株的Ml又PmRNA表达水平升至0.907士0.330，两者间有显著性差异（P<0.01）。3.4、SACC细胞内四种化疗药物的浓度显著高于SACC/DDP细胞。在采用MRP失活剂sta盯。、prine与sAcc/DDP细胞共同孵育2小时后，再与化疗药物相互作用，经检测发现，SACC/DDP细胞内化疗药物的浓度明显回升。 结论:1、运用恒定浓度的顺铂、周期性作用的方法，可诱导产生对顺铂明显耐受的细胞株，其细胞形态、群体倍增时间都较原细胞株有显著变化，且有良好的抗药保持性。2、该细胞株对多种不同结构和作用原理的化疗药物产生了不同程度的耐受，表明具有多药耐药的特性:经检测发现SACC/DDP细胞与亲代的SAcc细胞比较，细胞周期出现显著变化，GO/G:期细胞比例下降，而GZ/M期比例上升，与化疗药物浓度密切相关;对于SACC/DDP细胞，其化疗药物诱导凋亡率呈现显著下降趋势，Bax表达率也明显下降，在多组药物中与亲代细胞呈现显著差异。3、SACC/DDP细胞的细胞浆中以及细胞膜上MRP蛋白的表达率很高，这种过度表达可能是SACC/DDP细胞产生多药耐药的机制所在。