器官移植已经成为治疗脏器功能衰竭的一种重要方法，随着器官移植研究工作的发展，临床器官移植需要大量可供移植的器官，供体器官的短缺，成为限制器官移植发展的主要障碍。不同种属动物间器官移植重新受到人们的关注，异种移植被认为是解决人类供体器官短缺的潜在途径，可能会从根本上解决目前器官移植工作面临的困难，然而异种移植后将出现比同种异体移植更为复杂的排斥反应———超急性排斥反应(hyperacute rejection，HAR)，是异种器官移植后面临的第一个，也是最重要的免疫学障碍。超急性排斥反应是由天然存在的抗体及补体介导的，在数分钟内发生的导致移植物缺血坏死的剧烈反应。异种天然抗体、补体系统、内皮细胞三者被称为超急性排斥反应的三大障碍，其中补体系统的激活最为关键。目前防治超急性排斥反应的方法主要为天然抗体清除，抑制补体激活以及基因水平进行调控，均可延缓和/或阻止超急性排斥反应的发生发展。但是天然抗体的清除，只能延缓超急性排斥反应的发生，并不能阻止超急性排斥反应的发生；基因工程治疗，技术难度大，花费高，仍处于实验研究的起步阶段。 虽然抑制补体激活用于HAR的治疗也还是处于探索阶段，但由于补体的激活是HAR发生的关键因素，因而越来越多的学者认为在早期抑制补体激活有可能成为防治HAR、开发新的治疗药物的新思路。 重组蛇毒纤溶酶(recombinant fibrinogenase FⅡ，rFⅡ)是本课题组用基因工程的方法自行研制的新型溶栓药。前期的研究工作证实，rFⅡ能高效的溶解血栓，对炎症因子TNF有降解作用，提示可减轻HAR的病理改变；而且rFⅡ可降解补体C3、C5、C6和C9，提示rFⅡ可通过降解补体防治HAR。 研究目的： 1.研究重组蛇毒纤溶酶rFⅡ对超急性排斥反应的作用； 2.探讨重组蛇毒纤溶酶rFⅡ对超急性排斥反应的作用机制。 方法及结果： 1.重组蛇毒纤溶酶rFⅡ的制备 用基因工程的方法，构建了重组蛇毒纤溶酶rFⅡ的表达质粒，在真核表达系统酵母菌中获得高效表达。经western blot检测，证明了重组蛇毒纤溶酶rFⅡ与天然的蛇毒纤溶酶高度同源，其纯度达到了SDS—PAGE单一条带。通过离子交换和疏水层析，最终获得了高纯度的重组蛇毒纤溶酶rFⅡ。纯化的重组蛇毒纤溶酶rFⅡ通过激光飞行时间质谱分析，其质谱峰单一，其分子量大小为27.4KDa。对重组蛇毒纤溶酶rFⅡ进行HPLC分析，结果与质谱的结果一致，表明了重组蛇毒纤溶酶rFⅡ是一个成分单一的高纯度重组蛋白。 2.重组蛇毒纤溶酶rFⅡ体内外降解补体的作用 将补体C3.C5.C6、C9分别与重组蛇毒纤溶酶rFⅡ混匀在37℃温育2h，用SDS—PAGE观察反应产物的结果；将不同剂量的rFⅡ与大鼠血浆混匀，在37℃温育2、6、12h，再进行CH50测定，观察其补体活性的变化；从大鼠的股静脉滴注低、中、高剂量的rFⅡ，用ELISA法检测各组大鼠血浆中的补体C1q、C3、C4的水平。 结果表明：10μg/ml的rFⅡ在37℃温育2h，对补体蛋白C3、C5、C6、C9有降解作用；10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml的rFⅡ与大鼠血浆在37℃预温育2、6、12h，能显著降低补体活性；从大鼠股静脉滴注低、中、高剂量的rFⅡ，能显著的降低补体C1q、C3、C4的含量。 3.重组蛇毒纤溶酶rFⅡ在人血浆灌注大鼠离体心脏的超急性排斥反应中的作用 采用Langdorff离体器官灌注系统，建立人血浆灌注大鼠离体心脏的超急性排斥反应模型。观察重组蛇毒纤溶酶rFⅡ对人血浆灌注大鼠离体心脏的超急性排斥反应的作用。实验分为6组：K—H空白对照组，人血浆灌注组，人灭活补体血浆灌注组，rFⅡ分三个剂量组：10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml。进行血流动力学测定，血浆补体含量的测定以及观察离体大鼠心脏的存活时间。 结果表明：在人血浆灌注组，大鼠心脏的心率迅速下降，LVDP迅速下降，大鼠离体心脏的存活时间仅为15.94±4.75min，C1q、C3、C4的含量也明显下降(p<0.05)，标志超急性排斥反应的发生。在补体灭活血浆灌注组，大鼠心率，及LVDP缓慢下降，与缓冲液组无明显差异，大鼠离体心脏的存活时间为94.62±23.91 min，血浆补体含量的变化也没有统计学意义的差异。rFⅡ灌注组中，大鼠心率，及LVDP缓慢下降(与人血浆灌注组比较，P<0.05)，血浆中的补体含量在实验前也显著的下降(P<0.05，与人血浆灌注组比较)，离体大鼠心脏其生存时间均不同程度的增加(与人血浆灌注组比较，P<0.05)；尤其是高剂量组的rFⅡ组，其补体含量的下降至很低的水平，在离体大鼠心脏在体外灌流前后，补体C1q、C3、C4的含量均无明显变化，存活时间也提高至92.36±16.63min。这提示了，高剂量的rFⅡ可使补体含量降至较低的水平，从而并不会引起补体的激活。 4.重组蛇毒纤溶酶rFⅡ在豚鼠一大鼠异种心脏移植的超急性排斥反应中的作用 参考Ono氏方法，将豚鼠心脏异位移植于大鼠腹部，建立豚鼠一大鼠异种心脏移植的超急性排斥反应的模型。实验分为4组： HAR阳性对照组；低、中、高剂量rFⅡ组(分别为0.1mg/kg/h、0.2mg/kg/h、0.5mg/kg/h)。记录从血流恢复供心复跳至供心完成停止跳动的时间；在心脏移植前及供心完成停止跳动时，取动脉血，检测血浆中补体C1q、C3、C4的含量；移植心脏停止跳动后，供体心肌用10％甲醛固定，常规HE染色及补体C3的免疫组化检查。 结果表明：在心脏移植手术后，HAR对照组供心其存活时间仅为0.32±0.12h，肉光镜下病理检查发现，心肌细胞坏死，有炎性细胞浸润，间质出血伴血小板血栓，免疫组织学分析显示，补体成分广泛沉积于心脏血管内皮细胞膜。ELISA检测，受体血清补体C1q、C3、C4的含量均显著的下降。以上提示了本组供心已发生了剧烈的超急性排斥反应，供心迅速死亡。 在rFⅡ给药组中，由于在移植前受体的补体含量已下降至较低的水平，从而抑制了补体激活，使供心的生存时间均明显的增加，病理检查发现，供心损伤程度比HAR阳性对照组有明显的减弱。细胞水肿程度有不同程度的减轻，血栓也明显的减少，甚至消失，心肌细胞的坏死也不同程度的下降，仍可见完整的心肌细胞。尤其是高剂量组的rFⅡ组，其补体含量的下降至很低的水平，在异种心脏移植前后，补体C1q、C3、C4的含量均无明显变化，存活时间也提高至12.92±3.31h，免疫组化可见，仅有少量的补体C3附着于心脏血管内皮细胞膜，尤其在大剂量组中，几乎未见补体C3附着于心脏血管内皮细胞膜。这说明了，由于重组蛇毒纤溶酶rFⅡ可以明显的降低血浆中的补体，可以有效的延缓和/或抑制超急性排斥反应，显著地提高供心的生存时间。 5.重组蛇毒纤溶酶rFⅡ降解膜攻击复合物(MAC)的作用 将HUVECs细胞与不同剂量的重组蛇毒纤溶酶rFⅡ在37℃孵育1h。观察rFⅡ对HUVECs细胞活性的影响。HUVECs细胞分别与不同剂量的C56和C7，C8，C9在37℃孵育从而在HUVECs细胞膜表面组装MAC，检测上清中乳酸脱氢酶(lactatedehy drogenase，LDH)的含量，判断MAC沉积对细胞膜完整性的影响。建立MAC亚溶破HUVECs细胞模型，实验分4组，空白对照组，rFⅡ预先给药低剂量组(1μg/ml)，rFⅡ预先给药高剂量组(10μg/ml)，rFⅡ给药组(10μg/ml)。用激光共聚焦法观察重组蛇毒纤溶酶rFⅡ降解MAC的作用。 结果表明：1，5.0，10μg/ml的rFⅡ不影响HUVECs细胞活性。而20μg/ml的rFⅡ则使HUVECs细胞活性下降。在C56用量≤1.0μg/孔时；上清中LDH的释放较少(<10％)说明此时细胞溶破发生很少，当C56用量>1.0μg/孔时，细胞LDH释放明显增多，说明细胞膜的完整性可能受到破坏；将C56与后续的补体成分一起与HUVECs孵育组装MAC，激光共聚焦显微镜观测，可见细胞膜表面有大量的MAC沉积；将1μg/ml、10μg/ml的重组蛇毒纤溶酶rFⅡ预先与补体C56、C7、C8、C9，37℃孵育，再进行MAC体外组装。激光共聚焦显微镜观测，可见细胞膜表面有的MAC沉积有不同程度的消失，在大剂量重组蛇毒纤溶酶rFⅡ组中，几乎未见MAC沉积。而将10μg/ml的重组蛇毒纤溶酶rFⅡ与已附有MAC的HUVECs细胞在37℃孵育1h后，用激光共聚焦显微镜观测，仍可见细胞膜表面有大量的MAC沉积。 结论： 1.重组蛇毒纤溶酶rFⅡ能降低人血浆补体C1q、C3、C4的含量；降低CH50活性，降解补体C3、C5、C6、C9。 2.重组蛇毒纤溶酶rFⅡ显著提高人血浆灌注离体大鼠心脏的HAR的存活时间；rFⅡ能迅速恢复人血浆灌注离体大鼠心脏的HAR的心功能，并维持在一定的正常范围。 3.重组蛇毒纤溶酶rFⅡ能显著提高豚鼠—大鼠异位心脏移植所诱发HAR的供心存活时间. 4.重组蛇毒纤溶酶rFⅡ可以通过降解补体来抑制MAC的形成；rFⅡ对已经形成的MAC无明显的降解作用。