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组蛋白甲基化酶SMYD3 (SET and MYND domain-containing protein 3)是乳腺癌等癌症中的重要调控因子,而雌激素信号通路的异常活跃以及雌激素代谢产物亦与乳腺癌的发生发展密切相关。然而,关于SMYD3在雌激素代谢中的作用,迄今为止尚未见有相关报道。鉴于此,本论文围绕SMYD3对CYP1A1、CYP1B1两种雌激素Ⅰ相代谢酶的转录调控作用机制,加以较为系统的研究,以期为乳腺癌的发生发展、预防治疗、合理用药及新药研发提供新的理论基础。本文首先用不同浓度的17β-雌二醇(E2)对人乳腺癌细胞MCF-7进行处理,RT-PCR、Western blot分析发现CYP1A1、CYP1B1的表达量均可随E2浓度的增加呈现剂量依赖性的上调。在采用RNA干扰特异性抑制内源性SMYD3表达后,CYP1A1、 CYP1B1的转录表达均进一步显著上升,同时高效液相色谱(HPLC)分析也证实细胞培养液中E2的残留量随之减少,而细胞内E2代谢产物20H-E2及40H-E2的产生量一则相应增多。此外,Real time RT-PCR及免疫组织化学分析表明SMYD3在乳腺癌细..胞及组织中的表达量均明显高于正常乳腺细胞及癌旁组织,而CYP1A1、CYP1B1 的表达水平则与SMYD3的表达量呈明显的负相关。这些结果表明：SMYD3可下调乳腺癌细胞中CYP1A1、CYP1B1的转录表达,并因此抑制雌激素的Ⅰ相代谢反应。接下来,通过对CYP1A1、CYP1B1启动子区域序列分析,发现二者均含有多个SMYD3结合位点(SBE)。荧光素酶报告分析及染色质免疫共沉淀(ChIP)实验结果显示,SMYD3可与CYP1A1启动子区-281位的SBE及CYP1B1启动子区-21位的SBE.结合,增强该区域的组蛋白H4K20甲基化修饰水平。将甲基化功能缺失的SMYD3突变体(SMYD3ANHS E)转染到MCF-7细胞中后,Real time RT-PCR分析显示SMYD3对CYP1A1的转录抑制作用基本解除,而对CYP1B1的转录抑制作用则部分解除。表明SMYD3对CYP1A1的转录抑制作用主要是通过催化CYP1A1启动子-281位SBE区域的组蛋白H4K20发生甲基化而产生的,而其对CYP1B1的转录抑制除了催化CYP1B1启动子区-21位SBE区域的组蛋白H4K20甲基化外,还存在其它机制。结合本课题组前期的miRNA表达谱芯片结果及生物信息学分析,发现在CYP1B1的3’UTR中存在有SMYD3下游靶基因miR-200c的结合位点(MRE),利用荧光素酶报告分析、RT-PCR、Western blot等实验,研究证实miR-200c可通过与CYP1B1 3’UTR的结合抑制其翻译过程。不仅如此,伴随着E2浓度的降低,MCF-7细胞中miR-200c的表达量呈现显著的增加,而CYP1B1则呈现出明显的下调,二者具有明显的负相关关系。这些结果表明SMYD3的下游靶基因miR-200c也是CYP1B1的重要负调控因子,其在E2及SMYD3对CYP1B1的转录调控过程中发挥了重要作用。