【摘 要】
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目的:采用响应面法优化蔷薇红景天总黄酮提取纯化工艺,体内实验研究总黄酮提取物的急性毒性及抗炎作用,Aβ25-35诱导分化型HT22细胞建立细胞炎症反应模型,进行炎症因子相关指标的检测,探讨蔷薇红景天总黄酮粗提物、纯化物及其活性成分等对Aβ25-35诱导的分化型小鼠海马神经元细胞系HT22细胞炎症反应的抑制作用。方法:选取提取溶剂浓度、提取时间、物料比等3个因素为考察指标,采用响应面法分析优化蔷薇红
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目的:采用响应面法优化蔷薇红景天总黄酮提取纯化工艺,体内实验研究总黄酮提取物的急性毒性及抗炎作用,Aβ25-35诱导分化型HT22细胞建立细胞炎症反应模型,进行炎症因子相关指标的检测,探讨蔷薇红景天总黄酮粗提物、纯化物及其活性成分等对Aβ25-35诱导的分化型小鼠海马神经元细胞系HT22细胞炎症反应的抑制作用。方法:选取提取溶剂浓度、提取时间、物料比等3个因素为考察指标,采用响应面法分析优化蔷薇红景天总黄酮的提取工艺并进行验证实验;选择6种不同大孔吸附树脂对蔷薇红景天总黄酮进行吸附,筛选出合适的大孔吸附树脂类型;考察上样液流速、上样液浓度、上样体积、上样液p H等对蔷薇红景天总黄酮优化影响;在单因素试验的基础上,采用响应面法优化蔷薇红景天总黄酮的纯化工艺并进行验证试验;通过建立二甲苯致小鼠耳肿胀急性炎症模型,考察蔷薇红景天总黄酮对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响,通过建立棉球诱发大鼠肉芽肿慢性炎症模型,考察蔷薇红景天总黄酮对大鼠棉球肉芽肿形成的抑制作用,ELISA试剂盒测定慢性炎症大鼠血清中TNF-α、COX-2、IL-6、MAPK等炎症相关因子的含量,考察蔷薇红景天总黄酮的抗炎作用,通过急性毒性试验,观察蔷薇红景天总黄酮的急性毒性;在体外采用β淀粉样蛋白活性片段Aβ25-35诱导分化型HT22细胞建立细胞炎症反应模型,采用MTT法筛选出各药物组安全浓度范围、最佳用药浓度;选取模型组(Aβ25-35 15?mol/L)、阳性对照组（多奈哌齐12.5?mol/L）、纯化物（6.25、12.5、25?g/m L）、粗提物（12.5、25、50?g/m L）、红景天苷（2.5、5、10?mo L/L）、草质素（5、10、20?mo L/L）作为后续试验干预剂量,酶联免疫法检测细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2等炎症相关因子的分泌量,Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。结果:1)响应面法优化蔷薇红景天总黄酮提取工艺为:乙醇浓度70%、提取时间60 min、物料比1:40 g/ml;在此条件下,蔷薇红景天提取物中总黄酮的含量为56.96%;2)响应面法优化总黄酮纯化工艺为:用HPD600型树脂,上样液浓度为2.0035 mg/ml、洗脱液浓度为90%乙醇、洗脱液体积为2 BV柱床体积。在此工艺条件下,蔷薇红景天总黄酮含量为82.83%,纯化后总黄酮含量比提取物的总黄酮含量提高了26%。3)蔷薇红景天总黄酮低、中、高剂量组对二甲苯致小鼠耳肿胀均有显著抑制作用,其抑制率分别为25.75%、38.87%和61.13%;蔷薇红景天总黄酮低、中、高剂量组对大鼠棉球肉芽肿的形成均有明显抑制作用,其抑制率分别为42.06%、53.89%、54.15%;蔷薇红景天总黄酮低、中、高各剂量组均能显著降低大鼠血清COX-2、MAPK、TNF-α和IL-6的含量;通过急性毒性试验发现红景天总黄酮无毒性。4)Aβ25-35浓度为15?mol/L时细胞存活率为67.97%,细胞模型最佳,MTT法结果显示:与模型组相比,通过不同剂量各给药组的干预,能明显降低Aβ25-35对分化型HT22细胞的损伤,各药物各剂量组均可明显提高细胞存活率;ELISA实验结果显示:与正常组比较,模型组IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2的分泌量增加,与模型组比较,阳性对照组及各药物组均能减少IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2的分泌量,差异有统计学意义（P＜0.05）;凋亡结果显示:与模型组相比,阳性对照组及各药物组细胞凋亡率均降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:响应面法优化得到的蔷薇红景天总黄酮提取及纯化工艺参数条件是可靠的,实测值与理论预测值相符良好,具有一定的实际应用价值。通过体内外实验发现蔷薇红景天总黄酮具有一定抗急、慢性炎症作用,安全无毒,并且对Aβ25-35诱导分化型HT22细胞损伤有保护作用。
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