心力衰竭(chronic heart failure, HF)是指心脏不能维持足够的心输出量以满足身体对代谢的需要和静脉血回流受阻的状态。心力衰竭是许多心血管疾病终末期的表现,是目前世界上面临的主要健康问题。根据欧洲心脏病学会(ESC)估计[1],在欧洲47个国家的10亿人口中患有心力衰竭者约占总人口的5%。美国Framingham、心脏研究也表明,心力衰竭人群的患病率和发病率随着年龄的增加而大幅度升高,人群中50岁年龄段者心力衰竭的患病率为1%,80岁年龄段则可升至10%,其中心力衰竭的年发病率在45-54岁人群中为0.2%,而在85-94岁年龄段则为4%。我国2000年大样本调查结果表明,心力衰竭者发病率为0.9%,随着年龄的增高,心力衰竭的发病率显著上升。心力衰竭预后差,死亡率高,研究表明,心力衰竭患者5年总死亡率及心功能Ⅲ-Ⅳ级患者的2年内死亡率均高于50%,其中约有30-40%的患者因发生恶性室性心律失常而猝死。因此,提高心力衰竭后心功能及防治心衰后室性心律失常是提高心力衰竭患者预后的重要措施。心力衰竭时心肌收缩力呈渐进性明显下降,其基本环节是心肌细胞兴奋-收缩偶联的钙瞬变发生异常。RyR是一种细胞内钙释放通道,它位于肌浆网与细胞膜和T管L型钙通道相对应的交接处,与L型钙通道构成心肌细胞兴奋收缩偶联的基本功能单位。根据编码基因的不同,RyR可分为3个亚型：RyR1、RyR2、RyR3,在心肌组织中主要表达为RyR2,研究表明,在心力衰竭发生发展过程中,RyR2的结构和功能发生异常的改变。在生理情况下,心肌组织保持正常的节律性收缩依赖于每次心肌收缩后细胞内的钙离子能够迅速被清除,这主要通过肌浆网上的钙ATP酶(SERCA2a)将胞浆内的Ca2+泵回到肌浆网,此外,细胞膜上的钠钙交换体(NCX)也可将胞浆内的Ca2+排出细胞外,两者作用的结果使胞浆内的钙离子降低至初始浓度,心肌可恢复到舒张状态。心力衰竭时心肌钙瞬变的正性肌力作用减弱,心脏射血分数降低。大量研究证实,心力衰竭时心肌细胞的动作电位时程(the action potential duration, APD)是延长的,并呈间歇依赖和不同区域的复极离散度加大,与此同时,衰竭心肌的有效复极不应期也明显延长,并且与左心室舒张末期压力呈正相关,即心力衰竭越严重,心肌有效复极不应期越长。我们知道,心肌细胞复极电流主要由钾、钙及钠钙交换体电流参与。瞬间外向钾电流(transient outward potassium current, Ito)是钾电流中一个重要成分,主要发生在动作电位复极1期,Ito的降低可对动作电位平台期产生明显影响,这在很大程度上导致了心力衰竭时动作电位时程和有效不应期的明显延长。钠钙交换蛋白(sodium-calcium exchanger, NCX1)是膜蛋白超家族一员,是一种非ATP依赖的双向转运蛋白。它有正向转运和反向转运两种模式,多数研究表明,在心力衰竭的患者或动物模型中,心肌细胞NCX1的表达出现升高。然而,对于慢性心力衰竭时NCX1的作用机制,不同的研究结果则不尽相同,但是不管NCX1是正向转运还是反向转运,均有可能导致心律失常的发生。心肌细胞间的电兴奋通过缝隙连接进行传导,CX43是细胞间缝隙连接的主要蛋白之一。心力衰竭时,CX43蛋白数量、分布、结构等的改变对缝隙连接的活性和功能有重要影响。参松养心胶囊主要由人参、黄连、甘松、麦冬、山茱萸、丹参、炒酸枣仁赤芍、桑寄生、土鳖虫、南五味子、龙骨等12味中药组成,具有活血通络,益气养阴,清心安神的作用。目前,对参松养心胶囊研究较多的是临床对比观察治疗心律失常的疗效比较及采用膜片钳技术研究单离子通道的电流变化情况,然而,直到目前为止,对于离子通道的上游调节研究甚少。基于此,本实验采用主动脉瓣反流和腹主动脉缩窄的方法,建立日本大耳兔心力衰竭模型,检测参松养心胶囊对心力衰竭心功能的影响,观察心室肌细胞瞬时外向钾电流通道蛋白kv4.2,肌浆网(SR)Ca2+释放通道RyR2,肌浆网钙泵SERCA2a,钠钙交换蛋白NCX1及缝隙连接蛋白(CX43)的基因和蛋白表达变化,并研究参松养心胶囊对其表达的影响,探讨参松养心胶囊可能的作用机制。为心力衰竭的临床治疗提供实验依据。一、兔慢性心力衰竭模型的建立及参松养心胶囊的干预目的用主动脉瓣返流术联合腹主动脉缩窄术方法建立日本大耳兔慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)模型,观察参松养心胶囊对CHF兔心功能及心室结构的影响。方法健康日本大耳兔分为三组,分别为假手术组(sham operation, SO组)、心衰对照组(heart failure, HF组)、心衰参松养心胶囊干预组(heart failure with Shen Song Yang Xin, SSYX组；)。8周后分别观各组家兔生存情况和心衰指标。利用超声心动图观察各组模型术前、术后左室收缩末期内径(the left ventricular end-systolic diameter, LVESD)、左室舒张末期内径(the left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、左室射血分数(left ventricular shot ejection fraction, LVEF)、左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening, LVFS);动物处死后立即测量心脏重量,计算心脏体重比。结果在整个研究过程中,假手术组大耳兔死亡2只,心衰对照组死亡6只,心衰参松干预组死亡4只,总死亡率为33.33%,心衰组和参松养心胶囊干预组死亡率无差别。心衰组和参松养心胶囊干预组LVESD、LVEDD、心脏体重比高于假手术组,LVEF、LVFS值较假手术组低(p<0.05)；参松养心胶囊干预组LVESD、 LVEDD、心脏体重比均小于心衰组,LVEF值较心衰组升高(p<0.05)。结论采用主动脉瓣返流术联合腹主动脉缩窄术方法建立兔慢性心力衰竭模型技术可靠,参松养心胶囊对心力衰竭左心室功能降低和扩大有抑制作用。二、参松养心胶囊对心力衰竭兔左室心肌肌浆网钙调控的影响目的心力衰竭时心肌收缩功能下降与肌浆网钙调控密切相关,本研究通过观察参松养心胶囊对慢性心力衰竭家兔左室心肌细胞肌浆网膜上的ca2+释放通Ryanodine受体2型(Ryanodine, RyR2)、肌浆网钙ATP酶(sarco-endoplasmic reticulum ATPase2a,SERCA-2a)蛋白及mRNA表达变化,探讨参松养心胶囊对心力衰竭心脏功能作用可能的分子机制。方法兔腹主动脉缩窄术后6周,取各组模型左室心肌组织,利用免疫印迹技术(western blot)测定假手术组和心衰组家兔RyR2受体、SERCA-2a的蛋白含量。利用逆转录定量PCR技术测定假手术组和心衰组家兔心室肌RyR2受体、SERCA-2a的mRNA表达变化。结果1.心衰对照组左室心肌RyR2受体、SERCA-2a蛋白含量较假手术组明显减少,分别下降42.68%、40%(p<0.05); RyR2受体、SERCA-2a的mRNA表达明显低于假手术组(p<0.05),其下降程度分别为49.70%、73.01%。2.与心衰对照组比较,参松养心胶囊干预组RyR2受体蛋白含量及mRNA表达明显增高(p<0.05),但仍低于假手术组；SERCA-2a mRNA表达较心衰对照组明显增高(p<0.05),但仍低于假手术组,SERCA-2a蛋白含量均有所增加,但未达到统计学差异。结论1.慢性心力衰竭家兔心室肌细胞RyR2受体、SERCA-2a蛋白含量及mRNA表达下降,提示RyR2受体、SERCA-2a均参与慢性心力衰竭时肌浆网钙调节异常的发生发展。2.在早期对家兔慢性心力衰竭模型给予参松养心胶囊干预可改善细胞内肌浆网钙调控蛋白的改变,其机制可能与参松养心胶囊对肌浆网钙释放通道亚单位RyR2、肌浆内质网钙摄取亚单位SERCA-2a的mRNA和蛋白表达重构抑制作用有关,提示参松养心胶囊可改善左心室的收缩功能。三、参松养心胶囊对心力衰竭心室肌电重构的影响目的参松养心胶囊具有治疗心律失常作用,具体机制尚未阐明,本研究对负荷联合压力诱导的心力衰竭兔进行早期给予参松养心胶囊干预,兔腹主动脉缩窄术后6周对各组模型行左心室在体电生理检测。取左室游离壁心肌组织,观察瞬时外向钾电流(transient outward potassium current, Ito)通道孔道Kv4.2a亚单位、钠钙交换体1(sodium-calcium exchanger, NCX1)、缝隙连接蛋白43(connexin43, Cx43)的电重构作用,探讨其改善心力衰竭心功能及心律失常可能的机制。方法利用免疫印迹技术(western blot)检测假手术组、心衰组和心衰参松养心胶囊干预组家兔心室肌Kv4.2a亚单位NCX1、Cx43的蛋白含量。利用逆转录定量PCR技术检测假手术组、心衰组和心衰参松养心胶囊干预组家兔心室肌Kv4.2a亚单位、NCX1、Cx43的mRNA表达变化。结果1.与假手术对照组比较：心衰对照组左室心肌MAPD90、ERP和内、中、外膜TDR明显延长,室颤阈值(VFT)明显降低(P<0.05)；心衰组左室心肌Ito通道Kv4.2a亚单位、Cx43蛋白含量较假手术组明显减少(p<0.05),分别下降61.25%、49.83%；NCX1蛋白含量升高39.24%(p<0.05)。心衰对照组左室心肌Ito通道Kv4.2a亚单位、Cx43的mRNA表达明显低于假手术组(p<0.05),其下降程度分别为27.77%、48.31%；相反,NCX1mRNA表达较假手术组显著升高(p<0.05)。2.与心衰对照组比较,参松养心胶囊干预组MAPD90、ERP和TDR明显缩短,VFT明显升高(P<0.05)；参松养心胶囊干预组Kv4.2a亚单位蛋白含量及mRNA表达明显增高(p<0.05),但仍低于假手术组。NCX1蛋白含量明显降低(p<0.05), NCX mRNA表达有一定程度减少,但未有统计学差异。Cx43mRNA表达较心衰对照组明显增高(p<0.05),但仍低于假手术组；Cx43蛋白含量均有所增加,但未达到统计学差异。结论1.慢性心力衰竭家兔心室肌细胞Ito通道Kv4.2a亚单位蛋白含量及mRNA表达下降,提示Kv4.2a亚单位改变是心力衰竭后Ito电流变化的主要机制之一。2.慢性心力衰竭家兔心室肌细胞NCX1蛋白含量及mRNA表达升高,提示慢性心力衰竭时心肌细胞钠钙交换发生紊乱。3.慢性心力衰竭家兔心室肌细胞Cx43蛋白含量及mRNA表达降低,提示慢性心力衰竭时心肌细胞间缝隙连接功能降低。4.在早期对家兔慢性心力衰竭模型给予参松养心胶囊干预可抑制Ito、NCX1及Cx43的重构,其机制可能与参松养心胶囊对Ito的α亚单位Kv4.2、NCX1及Cx43mRNA水平的抑制作用有关,提示参松养心胶囊可抑制慢性心力衰竭左室心肌的电重构,降低心律失常的发生发展。