论文部分内容阅读
背景:乳腺癌是发达国家和发展中国家女性死亡率最高的癌症,其发病率也在稳步上升。线粒体作为已被熟知的细胞器,广泛参与了人体生理及病理的各个过程。哺乳动物细胞线粒体中包含一种进化保守的、ATP依赖的非折叠肽酶蛋白复合物ClpXP,它介导蛋白水解去除错误折叠的蛋白。有证据表明,该蛋白参与的通路可能调节线粒体未折叠蛋白反应(UPR),并参与了人类疾病的发病机制。ClpXP蛋白酶复合物由两种蛋白组成:AAA+ATP酶(ClpX)和酪蛋白水解蛋白酶P(ClpP)。ClpP是一种具有典型催化三联体结构域的丝氨酸蛋白酶。在哺乳动物中,ClpP由核基因编码,翻译后被运送到线粒体,并在线粒体基质中降解被氧化应激损伤的线粒体蛋白,在线粒体蛋白的质量控制中起着核心作用。在肿瘤学研究领域,ClpP基因的作用表现出一定的组织差异性。研究表明,与癌旁正常组织相比,胃腺癌中ClpP表达较低。在急性髓细胞性白血病(AML)细胞中,ClpP的表达高于正常造血细胞。然而,ClpP在乳腺癌中的表达和生物学功能尚未被研究。目的:本研究通过数据库和临床组织样本,检测乳腺癌组织和细胞中ClpP的表达水平,分析其与乳腺癌患者临床病理特征及预后的相关性,进一步探索ClpP的生物学功能和相关机制。方法:1、利用肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和Kaplan Meier-plotter数据库分析ClpP在乳腺癌组织中的表达水平,进一步探究其高低表达水平与临床病理特征的关系以及对乳腺癌患者预后的相关性。2、从18对乳腺癌及癌旁组织中提取mRNA,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测,分析两组样本中ClpP mRNA表达的差异。对29例乳腺癌和24例癌旁组织进行免疫组化染色(IHC),检测ClpP蛋白表达水平。3、在高表达ClpP的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和ZR-75-1中转染ClpP特异性小干扰RNAs(Small interfering RNAs,siRNAs),48h后通过RT-qPCR和蛋白质印迹实验(Western blot)进行敲减效率的验证,并通过克隆形成实验、transwell和流式细胞实验,对实验组与对照组细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡能力进行比较。4、采用Western blot,检测实验组和对照组中Src、PI3K、Akt等相关蛋白的表达情况。结果:1、通过对TCGA数据库数据的分析发现,与正常组织相比,ClpP在乳腺癌组织中的表达明显上调,差异具有统计学意义(p<0.001),其表达水平与T分期(p=0.0154)和ER水平(p=0.0164)显著相关。在Kaplan Meier-plotter数据库中,ClpP高表达与较短的无复发时间(RFS)相关(p=0.00071)。2、RT-qPCR和IHC的结果表明,ClpP mRNA和蛋白在乳腺癌组织中的表达均高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义(p<0.01)。3、通过克隆形成实验、transwell和流式细胞实验发现,相比于对照组而言,实验组细胞的增殖、迁移、侵袭能力被抑制,而凋亡增加。以上结果均具有统计学意义(p<0.01)。4、通过Western blot实验发现,与对照组相比,实验组细胞的Src、PI3K、Akt的磷酸化被抑制。结论:1、通过对TCGA数据分析发现,在乳腺癌组织中ClpP表达明显增加,并且ClpP的高表达与临床特征具有相关性。这些结果表明,ClpP具有较高的诊断潜力。进一步通过Kaplan Meier-plotter数据库发现,ClpP高表达与较短的RFS显著相关。说明ClpP在乳腺癌的发生发展中具有潜在的重要作用。2、通过RT-qPCR和IHC实验对人乳腺癌和癌旁组织样本中ClpP的表达行转录水平和翻译水平的分析,验证了对TCGA数据库数据分析中得出的关于ClpP在乳腺癌中高表达的结论。3、在敲低ClpP表达的乳腺癌细胞系中进行的相关功能实验中得出,si-ClpP能够抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭以及促进凋亡,这些结果进一步证实了ClpP的促癌作用。4、通过Western blot可以证实,敲低ClpP后能够抑制Src/PI3K/Akt信号通路,而该通路的激活能够促进肿瘤细胞的增殖,侵袭、迁移等行为。该机制的研究结果与功能试验的结果是一致的,进一步说明了ClpP在乳腺癌中的促癌作用是通过调控Src/PI3K/Akt信号通路进行的。