目的：　　人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是获得性免疫缺陷综合症(acquired immune defiency syndrome，AIDS)即艾滋病的病原体。HIV感染后感染者的疾病进程存在较大差异，研究影响HIV疾病进程的因素及生物学标志，将会对艾滋病治疗、免疫调节和疫苗研究具有重要意义。　　自然杀伤细胞(natural killer cells，NK cells)是天然免疫系统的主要组成部分，对病毒感染细胞和肿瘤细胞均发挥着重要的杀伤作用，其免疫应答早于获得性免疫，是机体的第一道防线。目前研究表明，HIV感染的疾病进程取决于感染早期的免疫应答情况[1]，因此，在感染早期就发挥作用的NK细胞越来越受到人们的关注。国际上的研究和我们课题组的报道亦证明，NK细胞的功能与HIV疾病进程密切相关。　　microRNA(miRNA，miR)是生物体内源性的长度约为21-25个核苷酸的单链非编码小RNA，通过与靶mRNA形成完全或不完全互补配对，在转录后水平对基因表达调控有重要影响。miRNA通过调控转录相关蛋白和信号通路中的关键分子，进而调控着细胞的发育和功能应答。研究表明miRNA能够调节NK细胞的发育和功能应答。在HIV感染过程中，NK细胞功能的变化是否受到miRNA的调控？HIV感染是否可引起某些miRNA的变化，进而影响NK细胞的功能，导致HIV疾病进程不同？目前HIV感染者miRNA研究主要集中在外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)，关于HIV感染者NK细胞miRNA的研究还未见报道。　　本研究采用流式细胞分选技术分选出HIV典型进展者(typical progressors，TPs)、快速进展者(rapid progressors，RPs)感染早期（120天）NK细胞以及健康对照者NK细胞，采用实时定量PCR技术进行NK细胞miRNA表达谱(510种）全筛检测及验证检测，并对miRNA靶mRNA进行预测，以探索HIV感染对NK细胞miRNA的影响，以及miRNA水平对HIV疾病进程的影响。　　材料与方法：　　1、研究对象　　本研究选取37例未经过高效抗病毒治疗（High active antiretroviral therapy,HAART）的HIV早期感染者（early HIV infection，EHI），以及5例HIV血清抗体检测阴性的健康者（HIV negative control，HNC）。HIV早期感染的定义符合国际标准[20]。37例EHI被分到2组，即快速进展者组（RP组）（感染一年后CD4+T细胞数量＜350 cells/μl）和典型进展者组（TP组）(感染一年后CD4+T细胞数量≥500 cells/μl)。所有HIV感染者NK细胞miRNA采样时间均为HIV感染120天。在miRNA全筛研究阶段（miRNA training group），我们对5例RP，5例TP及5例HNC的NK细胞510种miRNA进行检测。只有在RP组和TP组表达含量有明显差异（即P＜0.05）的miRNA才能进入miRNA验证检测研究阶段(miRNAvalidation group)。在miRNA验证研究阶段，我们选取11例RP和16例TP进行研究。37例HIV感染者均来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊确诊HIV感染的男男性接触人群。5例HIV血清抗体检测阴性的健康人，符合以下标准:HIV抗体阴性，血常规及肝肾功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗体阴性，无免疫系统疾病，未暴露于HIV的正常人。所有研究对象都签署了知情同意书。　　2、CD4+T细胞绝对计数、NK细胞绝对计数　　(1) CD4+T淋巴细胞绝对计数　　应用流式细胞仪FACSCalibur，MULTISET软件检测外周全血并进行自动分析，计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值。　　(2) NK细胞绝对计数　　应用流式细胞仪FACSCalibur，MULTISET软件检测外周全血并进行自动分析，计算NK细胞绝对值及相应比值。　　3、病毒载量的检测　　采用Roche公司COBAS(R) AMPLICOR HIV-1 MONITORTM Test, Version1.5试剂盒在COBAS(R)TaqMan(R)系统进行全自动PCR反应体系制备及病毒载量检测。　　4、NK细胞分选及纯度检测　　复苏液氮冻存的PBMC样本，离心400g，4℃，10分钟。离心结束后弃上清，将复苏的PBMC转移到流式管内。用TriTEST CD3 FITC/CD16+56 PE/CD45 PerCP试剂进行细胞表面染色，注意避光，4℃，30分钟。染色结束，洗去未结合染料，加入3ml/管无菌PBS，离心350g，4℃，5分钟。离心结束后弃上清，加入1.5ml无菌PBS，混匀细胞。PBMC样本在流式细胞分选仪FACSAriaⅡ进行分选，分选出NK细胞并进行纯度检测。　　5、NK细胞miRNA表达量的检测　　(1)总RNA的分离　　用预冷的PBS清洗细胞并计数，300g离心10min收集细胞样本;小心吸取出PBS后，加入650μl Lysis Buffer;涡旋振荡使细胞完全裂解。按照细胞与组织TotalRNA提取试剂操作说明书标准方法提取总RNA。　　(2) miRNA反转录生成cDNA　　首先在miRNA的3'尾部添加Poly A(A-Plus)，然后cDNA链的合成(RT-PCR)。全部操作按照Quanto-miR cDNA合成试剂操作说明书的标准方法进行。　　(3) qPCR反应　　miRNA反转录生成cDNA进行qPCR反应。全部特异性引物均来自microRNAprimer system（北京旷博生物技术有限公司，中国）。全部操作按照Quanto-miR检测试剂说明书进行，采用2-△△CT方法，检测miRNA的表达水平。　　6、靶mRNA预测及Pathway enrichment分析　　用miRecords（http://mirecords.biolead.org/）进行miRNA的靶mRNA基因预测。从结果中选择至少有3种算法能共同预测出的靶基因。然后将这些靶基因通过GeneGO MetacoreTM软件进行Pathway enrichment分析，设置P＜0.05。　　7、统计学分析　　用SPSS17.0统计软件及GraphPad Prism5.0软件进行统计分析。TP组，RP组及HNC组各组患者的基本信息、免疫学指标及病毒载量的比较，分类变量采用卡方检验，连续型变量采用独立样本t检验，非参数变量采用Mann-Whitney U检验。miRNA的表达水平与免疫学指标和病毒载量间的相关性分析采用Spearman秩相关检验。不同组间miRNA表达水平的差异用Mann-Whitney U检验分析。HIV感染者的血浆病毒载量用自然对数(log10)表示。受试者工作特征曲线(Receiveroperating characteristic curve，ROC curve)用来评价NK细胞miRNA表达水平预测疾病进程的诊断价值。Kaplan-Meier生存分析来分析感染早期NK内miRNA表达不同高低水平患者的生存情况。P＜0.05认为有统计学差异。　　实验结果：　　一、HIV感染者的基本情况　　HIV感染者CD4+T细胞绝对数、NK细胞绝对数及百分比均低于健康对照者。通过Loess曲线拟合观察到快速进展者CD4+T细胞绝对数及NK细胞绝对数持续高于典型进展者，病毒载量持续低于典型进展者。　　二、NK细胞分选纯度及总R队质量评估　　所有研究对象NK细胞分选纯度均在99％以上。从RNA浓度、A260/A280以及qPCR扩增实验来看，所有样本的RNA都成功提取，且cDNA质量也均通过质控。　　三、HIV感染者NK细胞miRNA全筛结果　　1、HIV感染者(HIV组)和健康对照者(HNC组)NK细胞miRNA差异表达　　与HNC组相比，HIV组NK细胞miRNA大多数表达含量下降，有41种miRNA相对含量显著下降，6种miRNA相对含量显著升高（P＜0.05）。　　2、TP组与HNC组NK细胞miRNA差异表达　　与HNC组相比，TP组有14种miRNA相对含量显著下降，6种miRNA相对含量显著升高(P＜0.05)。　　3、RP组与HNC组NK细胞miRNA差异表达　　与HNC组相比，RP组有71种miRNA相对含量显著下降，12种miRNA相对含量显著升高（P＜0.05）。　　4、TP组和RP组NK细胞miRNA差异表达　　与TP组相比，RP组NK细胞有30种miRNA相对含量显著下降，有12种miRNA相对含量显著升高(P＜0.05)。共计有显著差异变化的miRNA42种。　　四、HIV感染者NK细胞miRNA验证研究结果　　1、TP组与RP组验证研究结果　　扩大样本（TP组11例，RP组16例），对筛选到的影响HIV疾病进程的42种miRNA进行验证检测。结果显示:miR-302d相对含量在RP组显著升高(P=0.00058)。　　2、miR-302d的相对含量与CD4、病毒载量的相关性分析　　miR-302d相对含量与患者感染早期（120天）、感染1年后CD4+T细胞绝对数均呈显著负相关性（P=0.0008，r=-0.6087; P=0.0002，r=-0.6656），但是与病毒载量无相关性。　　3、ROC曲线分析miR-302d相对含量对HIV疾病快速进展的预测作用　　ROC曲线分析显示，HIV感染早期NK细胞miR-302d的相对含量对预测HIV疾病快速进展有高准确性（P=0.00046，AUC=0.903）。　　4、miR-302d相对含量不同的HIV感染者疾病进展的生存分析　　将CD4+T细胞绝对数＜350cells/μl，病毒载量＞104.5copies/ml作为结局事件，进行Kaplan-Meier生存分析，我们发现:miR-302d相对含量高的HIV感染者(“≥median”组)CD4+T细胞数量下降速率快(P=0.0002，log-rank x2=13.68)，病毒载量的下降速率无统计学差异。　　5、miR-302d相对表达量与NK细胞数量分析　　miR-302d相对含量与HIV感染早期（120天）、感染1年后NK细胞数量及百分比均无相关性。提示miR-302d是通过影响NK细胞功能，进而影响HIV疾病进程。　　五、miR-302d靶mRNA预测分析结果　　通过软件分析，预测了miR-302d靶mRNA基因，其主要在WNT signalingpathway， FAS signaling cascades，Granzyme B signaling pathway等信号通路中富集。推测在HIV早期感染时，miR-302d可能抑制发挥杀伤功能的mRNA表达，使杀伤功能下降，进而影响随后的疾病进程。　　结论：　　1、通过miRNA全筛研究发现，与典型进展者相比，快速进展者有30种miRNA表达显著下降，12种显著升高。　　2、通过42种miRNA验证研究发现，HIV感染早期患者NK细胞miR-302d的相对含量与HIV疾病快速进展密切相关。　　3、进一步分析结果证明，miR-302d对预测HIV感染快速进展具有潜在价值，是候选分子标志物。　　4、通过miR-302d靶mRNA预测，提示miR-302d可能调节NK功能相关的靶mRNA基因。