滤泡辅助型T细胞(Follicular Helper T,Tfh)是一种重要的CD4+T细胞亚群。它们的主要作用是辅助生发中心(Germinal Center,GC)的形成,支持GCB细胞的克隆选择,进而帮助机体产生针对外来病原体的高亲和力抗体,是维持有效的体液免疫反应必要的组成部分。独立于其它的细胞亚群,如Th1,Th2,或者Th17细胞,Tfh细胞有其专一的亚群决定因子,Bc16。研究表明,Bcl6缺失的T细胞完全丧失了分化为Tfh细胞的能力,而强制表达Bc16的T细胞则绝大部分分化为Tfh细胞。目前大部分的观点认为Bc16是一个抑制因子,即通过抑制其它亚群相关的基因促进Tfh细胞的分化。虽然Bc16对Tfh的发育至关重要,但在整个Tfh分化过程中,Bc16的表达量并非一直维持一致的水平,而是受到严格的调控。研究发现,多种因子参与Tfh的分化,包括细胞因子,共刺激分子,转录因子以及对重要因子功能有修饰或稳定作用的酶或伴侣分子。而这些分子对Tfh的调控大部分最终归结于对Bc16的调控。在本文中,我们的研究同样涉及对Bc16的调控,分为两部分。Tfh发育过程中,IL6刺激STAT3的磷酸化促进早期Bcl6的表达,而IL2则通过诱导STAT5的激活抑制Bcl6的表达。在本课题中,我们研究了另外一种分泌型分子细胞外基质蛋白1(Extracellular matrix protein 1,ECM1)在Tfh分化及抗体生成中的作用。以前的研究表明,ECM1可以通过抑制IL2信号促进K1f2的表达。而IL2-STAT5和K1f2均介导Tfh细胞分化过程中很重要的负调控信号。那么ECM1在Tfh分化过程中扮演什么角色呢?我们发现,在Tfh-like细胞中,缺失ECM1会导致STAT5磷酸化(p-STAT5)水平显著升高,而Klf2没有明显的变化。之后我们用完全弗氏佐剂complete freund’s adjuvant,CFA)乳化的KLH蛋白免疫Ecm1-/-和WT小鼠,发现在Ecm1-/-小鼠中Tfh的分化与生发中心的形成均明显弱于WT小鼠。而Ecm1-/-小鼠中Tfh和GC的发育缺陷可以通过抑制IL2信号通路挽救。之后,我们用混合骨髓重构实验和T细胞条件性敲除小鼠(Ecm1f/fCD4-Cre+/-)模型发现ECM1以一种部分自分泌的方式促进Tfh的分化。然后在Tfh-like细胞中,我们发现来自Tfh细胞本身的ECM1是由IL6和IL21介导STAT3的激活诱导表达。最重要的是,注射外源的ECM1可以显著增强流感病毒感染反应中Tfh的分化、生发中心的形成,以及病毒特异性中和抗体的产生。我们的这项研究发现了对小鼠Tfh分化有重要促进作用的第一个非细胞因子类的分泌型分子,完善了 Tfh发育过程中拮抗IL2信号通路的调控网络,并且为通过调控Tfh细胞免疫反应增强抗病毒策略提供新的潜力分子。在第二部分的研究中,我们试图筛选出在Tfh分化过程对BCL6有稳定作用的去泛素化酶。在大多数生理活动中,泛素化和去泛素化修饰是介导蛋白质降解与稳定的重要的翻译后修饰。而在Tfh分化过程中,研究发现Bc16的转录水平与蛋白水平存在很大的不一致性,暗示着翻译后修饰在BCL6的调控中发挥着重要作用。在本研究中,我们首先通过在293T细胞中共表达BCL6和去泛素化酶筛选到可以增加BCL6蛋白量的去泛素化酶。然后我们通过免疫共沉淀实验筛选到在293T细胞中可以与BCL6相互作用的去泛素化酶。Tfh-like细胞是在体外IL6和IL21刺激下,具有类似于体内Tfh细胞基因表达谱的激活的T细胞。因此,我们通过逆转录病毒介导293T中可与BCL6相互作用的去泛素化酶在Tfh-like细胞中的过表达,进而筛选到USP21和USP37在此细胞可以增加BCL6蛋白水平。为了研究这两种蛋白对Tfh的发育是否是必需的,我们引进了在T细胞中特异性敲除这两个基因的小鼠,即Usp21f/fCD4-Cre+/-和Usp37f/fCD4-Cre+/-。然后我们使用流感病毒感染以及OTII或Smart等过继转移实验模型检测这两个基因对体内Tfh分化的影响,但均未观察到预期的Tfh分化减少的情况。相应的生发中心的发育,以及IL21的产生在敲除小鼠或细胞中也未出现减少。我们的实验结果表明,虽然Usp21和Usp37的过表达可以在体外增加BCL6的蛋白水平,但对体内BCL6的调节以及Tfh发育并不是必需的。