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研究背景肝硬化(liver cirrhosis,LC)是严重的公共卫生问题,能导致门脉高压症、肝功能衰竭、肝癌等临床问题,是肝移植需求的最主要病因。肝硬化是由不同原因的肝脏损伤导致的坏死炎症和纤维化形成的结果,肝纤维化形成是一个复杂,紧密调控的过程,它是细胞外基质产生和降解之间形成的平衡,揭示肝纤维化的发病机制,对于肝硬化的治疗至关重要。炎症是驱动和维持纤维化的重要因素,而宿主的免疫反应是肝纤维化发生发展的关键。总的说来,肝纤维化是基质细胞、细胞外基质与白细胞之间相互作用的结果。尽管肌成纤维细胞和巨噬细胞被认为是肝纤维化发病机理的中心环节,但至今仍然存在很多未解决的问题,有必要定义不同类型的细胞对于肝纤维化形成的作用。近年来研究显示,B细胞除了分泌抗体以外,还具有重要的免疫调控功能。动物模型显示,B细胞能通过分泌细胞因子这种非抗体依赖的方式在肝纤维化发病机理中起促进作用。B细胞按照分泌的细胞因子谱和发挥功能的不同分为效应性B细胞(effector B cell,Be)和调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)。在感染、免疫、肿瘤等动物模型以及人体中都证实了调节性B细胞主要通过分泌IL-10产生强大的抗炎和负向免疫调控作用。IL-10也是重要的抗纤维化细胞因子,调节性B细胞作为B细胞中产IL-10的亚群,新近的研究显示其也参与了肝纤维化的发病机制,表现为慢性乙型肝炎患者外周血调节性B细胞的比例随肝纤维化程度的增加而增加。动物模型亦显示输注外源性调节性B细胞能减轻纤维化的程度。但调节性B细胞在肝纤维化中的研究尚缺乏更详尽的研究资料,因此,本研究拟从患者和动物模型两方面进一步明确调节性B细胞在肝纤维化发病机制中的作用。目前已经知道肝纤维化是一种可逆的过程,所以探寻抗纤维化的靶点和药物对于逆转肝纤维化至关重要。姜黄素(Curcumin)是从姜科植物姜黄中提取的一种天然酚类化合物。由于抗炎、抗氧化、抗突变、抗肿瘤特性,在一些国家已作为传统医药使用了上世纪。近年来,在很多动物模型中证实姜黄素还具有抗肝纤维化的作用,其中机制之一是姜黄素能调节免疫细胞的功能、促进IL-10的分泌,但尚不清楚姜黄素对于调节性B细胞有无作用。在GVHD(graft-versus-host disease,移植物抗宿主病)小鼠模型中姜黄素能促进脾脏不成熟B细胞比例的增加,我们推测姜黄素也能通过促进调节性B细胞的上调,增加IL-10的分泌,从而发挥抗纤维化的功能。本研究首先收集了慢性乙型肝炎、乙肝相关性肝硬化患者的外周血、肝组织标本,采用流式细胞术对外周血B细胞、调节性B细胞的比例进行分析,采用免疫组织化学方法对肝脏组织中B细胞、调节性B细胞、IL-10+细胞的数量进行分析,采用Luminex对血清IL-10等细胞因子进行分析,以明确B细胞、调节性B细胞以及IL-10与肝脏炎症和纤维化的关系。进一步建立CC14诱导的小鼠肝纤维化模型,分别采用流式细胞、免疫荧光、ELISA分析外周血、肝脏及脾脏组织B细胞、调节性B细胞的比例以及数量,IL-10等细胞因子的表达,明确B细胞、调节性B细胞以及IL-10在肝损伤和肝纤维化中的变化特点,并观察姜黄素对于小鼠肝纤维化的保护作用,探寻姜黄素通过上调调节性B细胞、促进IL-10分泌的抗肝纤维化的作用机理,这将有助于进一步完善姜黄素在肝病领域的作用机制研究,同时也为肝硬化治疗提供新的靶点和新的思路。方法第一部分乙肝相关性肝硬化患者调节性B细胞特点研究1、HBV-LC患者外周血调节性B细胞的变化特点收集32例CHB(chronic hepatitis B,慢性乙型肝炎)(24例患者行肝穿刺活检)、16例HBV-LC(HBV related liver cirrhosis,乙肝相关性肝硬化)患者及10例正常对照外周血,采用流式细胞术检测CD19+B细胞及其各亚群的分布。比较患者与正常对照外周血B细胞各亚群比例的差异,分析CD1 9+CD24hiCD388hi调节性B细胞比例与临床指标及肝脏炎症分级和纤维化分期的相关性。2、CHB、HBV-LC患者肝脏调节性B细胞分布特点收集CHB、HBV-LC共24例患者肝脏组织石蜡标本及10例正常肝移植供肝石蜡标本,采用免疫组织化学方法检测CD20+B细胞、IL-10+PAX5+调节性B细胞和IL-10+细胞在肝组织的浸润情况。比较患者与正常对照,以及不同炎症分级、纤维化分期患者之间组织中B细胞、调节性B细胞和IL-10+细胞计数的差异,分析其与临床指标及肝脏炎症分级和纤维化分期的相关性。3、HBV-LC患者血清细胞因子表达特点收集32例CHB、16例HBV-LC患者以及10例正常对照血清,采用Luminex方法检测Thl型细胞因子IFN-γ、TNF-α、TNF-[β、IL-12p40、IL-12p70、IL-15,Th2型细胞因子IL-5、IL-6、IL-10,Th17型细胞因子IL-17a,趋化因子IL-8、IP-10的表达水平。比较患者与正常对照细胞因子表达量的差异,分析HBV-LC患者血清细胞因子表达谱的特点及其与临床指标的相关性。第二部分姜黄素上调调节性B细胞、促进IL-10分泌抗CCl4致小鼠肝纤维化作用采用CC14反复腹腔注射建立小鼠肝纤维化模型,经姜黄素灌胃给药,检测小鼠血清ALT和AST水平,同时对小鼠肝组织以及脾组织进行HE染色、肝组织进行Masson染色,确认姜黄素对小鼠肝纤维化的保护作用。采用流式细胞术分析小鼠外周血、肝组织、脾组织内CD19+B细胞及CD19+CDldhiCD5+调节性B细胞比例;运用免疫荧光双标法,检测脾脏IL-10+PAX5+调节性B细胞、B细胞、IL-10+细胞分布及其在肝脏的浸润情况;并采用ELISA法检测小鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17a、TGF-β1 的表达。明确B细胞、调节性B细胞在CC14致小鼠肝纤维化发病机制中的作用,探寻姜黄素通过上调调节性B细胞、促进IL-10分泌发挥抗肝纤维化作用的可能性。结果第一部分乙肝相关性肝硬化患者调节性B细胞的变化特点1.HBV-LC患者外周血调节性B细胞的变化特点CHB、HBV-LC两组患者外周血CD19+B细胞比例与正常对照没有差别,CD19+CD24hiCD3 8hi调节性B细胞比例高于正常对照组。CD19+CD24intCD3 8int成熟B比例在HBV-LC组高于CHB组和正常对照组,CD19+CD24hiCD38-记忆B细胞比例在HBV-LC组低于CHB组和正常对照组。患者外周血调节性B细胞比例与G分级、S分期有正相关性趋势,与Child-Pugh评分无相关性。2.CHB、HBV-LC患者肝脏调节性B细胞分布特点CHB、HBV-LC患者肝组织CD20+B细胞、IL-10+细胞的浸润均高于正常对照,肝脏B细胞浸润与炎症分级(G)正相关,肝脏调节性B细胞、IL-10+细胞浸润与纤维化分期(S)正相关。3.HBV-LC患者血清细胞因子表达特点HBV-LC患者血清IL-10、IL-15、IL-6、TNF-α表达水平均较正常对照增高。血清IL-10表达与ALT、AST呈正相关,与IL-6、IL-15、IL-12p70、IL-17a、TNF-β表达呈正相关。第二部分姜黄素上调调节性B细胞、促进IL-10分泌抗小鼠肝纤维化作用CC14反复注射可以造成小鼠肝纤维化,血清ALT、AST水平较正常组明显增高;肝组织HE染色显示,肝细胞大量坏死,小叶结构紊乱,并伴有炎症细胞浸润;Masson染色示小鼠肝组织内胶原纤维较正常对照组明显增多,肝小叶纤维间隔形成。姜黄素治疗能显著减低小鼠血清ALT、AST水平,明显减轻小鼠肝细胞损伤和炎症细胞浸润,减轻肝纤维组织增生。CCl4反复腹腔注射后,模型组血B细胞比例较正常对照降低,肝、脾B细胞比例均没有变化,模型组脾调节性B细胞比例较正常对照降低,血、肝调节性B细胞比例无明显变化。姜黄素治疗后能上调模型组小鼠血B细胞比例以及脾脏调节性B细胞比例。模型组小鼠肝脏B细胞、调节性B细胞、IL-10+细胞浸润均增加。脾脏B细胞、调节性B细胞、IL-10+细胞较正常对照增多。姜黄素治疗后能上调模型组小鼠脾脏调节性B细胞及IL-10+细胞数量。小鼠肝、脾调节性B细胞、IL-10+细胞,以及肝脏B细胞数量与ALT、AST呈正相关。小鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-17a、IL-10、IL-4、TGF-β1水平均较正常对照组增高,姜黄素治疗后能提高血清IL-10表达水平,降低血清中IFN-γ、IL-2、IL-17a表达水平。血清IL-10表达量与血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17a和TGF-β1表达量呈正相关。结论1.乙肝相关性肝硬化患者外周血调节性B细胞比例增加,肝脏调节性B细胞数量增加。2.姜黄素具有肝纤维化的作用,其作用机制可能与其上调脾脏调节性B细胞、IL-10+细胞以及促进IL-10分泌增多有关。