结肠癌是世界范围内高发的恶性肿瘤之一，在全球范围内，结肠癌的发病率和死亡率在男性和女性患者中均位列第三位。目前研究认为，结肠上皮细胞遗传学的改变是导致结肠癌易感性的主要原因，如Ras/Raf, transforming growth factor (TGF)-β,β-catenin/T-cell factor (TCF)和p53通路等。在结肠癌演变过程中，基因的突变和微环境的改变进一步增加了结肠癌恶性表型的发生。因此，结肠癌的发生是一个多因素、多阶段、各种分子事件渐进性累积的复杂过程。尽管关于上述机制的研究已经逐渐明确，但导致结肠癌发生和恶性转变的关键因素仍然有待进一步的研究。TGF-β属于转化生长因子家族的成员，其通过自分泌或旁分泌的方式参与细胞内许多生物学行为的调控。经典的TGF-β信号通路是通过Smad蛋白家族来介导，主要参与成员是Smad2/3/4；另外，TGF-β还可以激活细胞内的多条信号通路来调节细胞的生物学行为，如：Ras/MAPK/ERK通路，JNK/P38通路，PI3K/AKT通路，RohA通路，PP2A/p70s6K通路等。TGF-β信号通路的活化与肿瘤的发生发展密切相关，并在不同环境下表现出促癌或抑癌的双向功能。目前的研究认为，TGF-β/Smad信号通路在正常的上皮细胞中主要发挥抑制细胞增殖的功能，这主要是通过对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p15和p21的诱导，以及对癌基因c-Myc的抑制效应来实现的；但在晚期的结肠癌细胞内，TGF-β通过诱导细胞EMT及侵袭和转移的发生导致其功能从抑癌向促癌转变。诱导TGF-β功能发生改变的原因很多，其中遗传学的改变导致TGF-β增殖抑制通路的突变失活被认为是最为重要的因素，例如：SMAD4, SMAD2和TGFBR2等。但同时有许多的研究显示，在结肠癌细胞内修复TGF-β缺陷的通路仍然不能有效激活TGF-β增殖抑制信号通路，这提示除了遗传学改变外的其他因素，可能也参与到了对TGF-β双向功能的调节。NDRG2（N-Myc Downstream Regulated Gene2）是我们课题组首次报道的新抑癌基因。它属于NDRG家族成员，该家族由NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4四个成员组成。课题组的前期研究结果显示NDRG2可以抑制胶质瘤细胞的增殖，并可以诱导多种类型细胞的分化，如树突状细胞，PC12细胞和结肠癌细胞等。另外，NDRG2在结肠癌等多种肿瘤组织中呈低表达状态，这与它作为肿瘤抑制基因所具有的潜在抑癌能力相一致。更重要的是，我们最近发现NDRG2的表达与结肠癌的恶性增殖、侵袭和转移具有显著的负相关性，其低表达状态与患者的不良预后密切相关，显示NDRG2是一新的结肠癌诊断标志物，为结肠癌的发病机制、临床病理联系及预后判断提供新的思路。【目的】1.揭示TGF-β在结肠癌演变过程中功能由抑癌向促癌转变的原因及影响因素；2.明确TGF-β对NDRG2调控的分子机制；3.分析NDRG2在结肠癌演变过程中表观遗传学的改变对TGF-β功能的调节；4.阐明NDRG2对结肠癌细胞EMT及细胞增殖过程的影响。【方法和结果】1. NDRG2与TGF-β通路在结肠癌演变过程中的相关性分析我们首先分别在50例结肠癌和癌旁的病理组织中通过免疫组织化学方法分析了p-Smad2/3C和肿瘤抑制基因NDRG2的表达状态。统计学分析显示，p-Smad2/3C和NDRG2在低分化的恶性结肠癌中呈低表达，两者的表达也具有显著的相关性。这提示NDRG2可能参与了TGF-β/Smad通路对细胞的周期调控及增殖抑制效应的过程。2. TGF-β通过Sp1、c-Myc、Miz-1和Smad复合体调控NDRG2的转录我们通过Western blot和Real-time PCR实验发现TGF-β在HaCaT细胞中可以从转录水平直接激活NDRG2的表达。并进一步通过报告基因分析和ChIP实验证明TGF-β通过调节HaCaT细胞内Smad2/3和Smad4的转录调节活性，激活NDRG2的转录；并且Sp1的过表达进一步提高了TGF-β诱导NDRG2的启动子活性；而干涉Sp1或NDRG2启动子的Sp1结合位点突变可显著抑制NDRG2的启动子活性；Sp1的抑制剂Mithramycin A作用细胞能够抑制TGF-β对NDRG2的转录激活活性，进一步说明TGF-β调控NDRG2依赖Sp1的参与；除此之外，报告基因实验的结果显示，c-Myc通过对Miz-1的转录调节作用抑制TGF-β对NDRG2的诱导表达，而Miz-1的过表达则可上调NDRG2启动子活性。由此可见，TGF-β可以通过Sp1、c-Myc、Miz-1和Smad复合体的介导，参与对NDRG2的转录调控。3. NDRG2在结肠癌细胞中对TGF-β功能的影响在晚期结肠癌细胞中，TGF-β/Samd通路通常发生突变失活，而TGF-β诱导的癌基因信号通路则被激活，TGF-β在这一阶段可通过诱导EMT（上皮-间质细胞形态转变）的方式促进肿瘤的侵袭和转移。我们通过形态学观察、Western blot和Real-timePCR分析发现，NDRG2的过表达可显著抑制TGF-β诱导HT-29细胞发生EMT，并从mRNA水平抑制TGF-β诱导的E-Cadherin和Vimentin表达的改变，提示NDRG2可能从转录水平影响着TGF-β对EMT的调节。为了进一步分析NDRG2对EMT导致的细胞恶性侵袭和转移等功能上的改变，我们利用Transwell实验观察了细胞侵袭和迁移能力的变化。结果表明，TGF-β的刺激提高了HT-29细胞侵袭和迁移能力，而NDRG2的过表达则显著抑制了TGF-β诱导的细胞恶性转变。因此，NDRG2作为TGF-β/Smad抗增殖通路的应答基因，在晚期结肠肿瘤细胞中发挥对TGF-β诱导的EMT发生的抑制效应。4. NDRG2表观遗传学的改变在结肠癌演变中的重要意义我们首先在多个结肠癌细胞株及正常结肠上皮细胞中比较了NDRG2表达的差异，并观察到NDRG2在大部分的结肠癌细胞内呈低表达；而NDRG2在结肠癌细胞的甲基化水平明显高于正常细胞，并与NDRG2的表达呈负相关；这一结果在结肠癌临床标本中得到了进一步的验证。另外，在NDRG2启动子高甲基化的细胞内过表达Sp1不能诱导内源性NDRG2的表达上调，但却保留了对外源转染的NDRG2启动子的转录激活能力。通过EMSA实验证明，Sp1结合位点区域的高基化状态显著抑制了Sp1与NDRG2启动子区靶位点的结合。而DNA甲基化酶抑制剂5-aza-dC的作用可以上调NDRG2的表达水平，并恢复Sp1对NDRG2的转录调节活性。为了探讨NDRG2对EMT的抑制效应在临床上的表现，我们在260例结肠病人标本中分析了NDRG2的表达与结肠癌侵袭能力、淋巴转移以及远端转移的相关性，显示NDRG2的表达与肿瘤的侵袭和转移能力呈显著的负相关，提示NDRG2作为肿瘤抑制基因，在发挥抗增殖效应的同时还可以通过对EMT的调控抑制结肠癌的侵袭和转移。5. NDRG2参与结肠癌生物学行为改变的分子机制结肠癌细胞在高生长密度时可抑制细胞增殖、促进细胞分化，基于这一细胞特性，我们利用Caco-2和HT-29细胞建立了结肠癌分化的模型，并发现在分化后的结肠癌细胞内NDRG2的表达上调及癌基因Skp2的表达下调。另外，在丁酸钠诱导的细胞分化模型中，我们也证实了二者之间的负相关关系。进一步，我们发现NDRG2的过表达可从转录水平抑制Skp2的表达，并同时上调Skp2的泛素化底物p27和p21的表达水平和蛋白稳定性。除此，NDRG2还可以从转录水平上调p21的表达，但不改变p27的mRNA水平。因此，NDRG2一方面通过抑制Skp2的表达增强了p27和p21在细胞内的稳定性，另一方面从转录水平诱导了p21的表达。由此我们推测NDRG2对Skp2，p27和p21的调控可能是其参与抑制细胞增殖和促进细胞分化的主要方式。最后，我们通过裸鼠皮下成瘤实验发现，NDRG2的过表达显著抑制了HT-29细胞的成瘤能力及细胞的增殖能力，p21或p27的干涉均不同程度地促进了瘤体的增殖，并可部分的解除NDRG2对肿瘤的增殖抑制效应。因此，NDRG2通过调节p21和p27的表达参与对结肠癌细胞增殖分化过程的调控。【结论】通过对本课题的研究，我们发现TGF-β可以通过Sp1、c-Myc、Miz-1和Smad复合体的介导，参与对抑癌基因NDRG2的转录调控。由于在晚期结肠癌中NDRG2启动子的高甲基化导致NDRG2对TGF-β的应答缺陷，从而导致TGF-β增殖抑制效应的缺失，而TGF-β诱导的EMT过程不能被有效地抑制，加速了结肠癌的演变和转移。