研究背景蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是常见的脑血管疾病之一,一种危及生命的神经系统疾病,具有较高的死亡率和致残率。SAH发生的主要原因是动脉瘤的自发破裂。随着神经外科诊疗技术的进步,许多SAH病人可以存活下来,但难以完全恢复正常的认知功能,因受认知障碍的困扰,从而使其生活质量下降。以往认为脑血管痉挛是导致SAH后神经损伤和认知障碍的主要原因,而越来越多的证据表明早期脑损伤(early braindamage,EBI)才是影响SAH患者不良预后的更为重要的因素。EBI是指蛛网膜下腔出血后72小时内所发生的脑损伤。区别于脑血管痉挛产生的脑损伤,EBI所涉及的病理生理过程更为复杂,包括颅内压和脑血流量改变、血脑屏障受损、神经元凋亡、小胶质细胞异常活化等。针对EBI进行深入研究,将有助于提出改善SAH患者预后的治疗手段,从而减轻家庭乃至社会负担。近期,间充质干细胞来源的细胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)或外泌体引起了许多关注,被认为是潜在的药物载体,同时有望替代基于间充质干细胞的细胞疗法。更重要的是,使用EV或外泌体(exosomes)可以规避细胞治疗的致瘤性等潜在安全问题。外泌体可以通过其包含的蛋白、脂质、mRNA和非编码RNA等成分调节受体细胞的功能。间充质干细胞EV或外泌体被证实可治疗肝损伤、肾损伤、急性心肌梗死等疾病。间充质干细胞疗法在20世纪初已被应用于卒中和创伤性脑损伤的治疗中。但最近的研究表明,间充质干细胞的分化成功能性细胞的能力较弱,其对于损伤修复的促进作用主要通过其所分泌的细胞因子和外泌体所介导。例如Michael Chopp等学者证明MSC外泌体可以被神经细胞接受,而且这些miR-133过表达的外泌体可以促进缺血性脑卒中神经功能恢复。虽然段传志等发现静脉输注间充质干细胞可以减轻SAH大鼠神经炎症介导的损伤,然而,间充质干细胞EV或外泌体在SAH的作用和机制仍不清楚,故深入探究间充质干细胞外泌体对SAH的干细胞治疗实际应用具有重要现实意义。本课题利用大鼠线栓穿刺法SAH模型,探讨了 MSC-EV对SAH后EBI的神经保护作用,揭示了 EV中的miR-21在认知障碍恢复中的分子机制。首先,通过给予尾静脉注射途径的MSC-EV干预,探究了 MSC-EV是否能减轻EBI中的病理改变,并进一步发现其通过抑制神经元凋亡发挥了神经保护作用的机制。而后,结合EV-RNA测序分析和SAH患者脑脊液miRNA芯片结果,筛选发现miR-21介导了 MSC-EV保护作用,并深入研究了 miR-21/PTEN/AKT轴在EBI过程中神经元应激和神经元凋亡的相关机制。本课题对SAH患者神经损伤恢复提供了潜在治疗手段,具有重要的临床应用价值。第一部分MSC-EV对于SAH大鼠后早期脑损伤的神经保护作用的研究1.目的(1)MSC-EV的分离和鉴定。(2)MSC-EV对蛛网膜下腔出血大鼠是否具有神经保护作用。(3)MSC-EV是否能够减轻大鼠在蛛网膜下腔出血后的认知障碍。(4)通过EV染色示踪技术确定MSC-EV的靶细胞。(5)MSC-EV对于神经元凋亡的分子保护机制。2.方法1、构建线栓穿刺法的大鼠SAH实验模型为研究蛛网膜下腔出血后早期脑损伤,我们选用了穿刺法模型,使用成年雄性SD大鼠,体重在280-330g范围内。麻醉大鼠后,分离颈动脉,自颈外动脉将尼龙线栓插入颈内动脉,进而深入颅内刺破前交通动脉,以完成模型构建。2、骨髓间充质干细胞EV的提取和鉴定培养大鼠骨髓间充质干细胞,收集细胞培养上清,利用超速离心法提取细胞外囊泡(EVs),通过qNano粒径分析系统、EV特异性蛋白的Western blot检测、电镜等方法对其进行特征鉴定。3、动物分组、给药成年雄性SD大鼠被随机分为假手术组(Sham组)、SAH组,SAH+EVs,其中EVs是提取自大鼠骨髓间充质干细胞的细胞外囊泡,通过尾静脉注射的方式给予SAH大鼠,剂量为100ug/只,SAH组则注射相同体积的PBS溶液。4、MSC-EV对SAH大鼠死亡率和行为学的影响观察并记录各组存活情况,并在SAH模型建立后48h,对各组大鼠进行改良Garcia神经功能学评分,以检测各组的神经行为学变化,评估MSC-EV对SAH大鼠神经功能的影响。5、MSC-EV改善SAH大鼠脑组织的组织学检测深度麻醉处死动物后,灌注取脑固定,制备石蜡切片,进行常规HE染色和尼氏染色观察水肿等病理表现;在此基础上利用TUNEL和NeuN/cleaved Caspase-3荧光染色检测神经元凋亡情况。6、凋亡相关蛋白及通路的检测处死动物后,分别提取前额叶皮质、海马组织进行蛋白提取,使用Western blot定量检测各组大鼠的凋亡相关蛋白的表达情况。7、水迷宫实验SAH造模两周后,对各组大鼠进行水迷宫实验,评估其SAH后的学习记忆功能恢复情况。实验前4天,放置隐藏平台,训练大鼠寻找固定位置的平台;第5天,撤去平台,观察各组大鼠对固定平台的记忆强度。8、EV荧光染色示踪利用PKH67染色的MSC-EV,联合神经细胞的免疫荧光染色,检测MSC-EV是否被神经细胞接受。3.结果(1)通过超速离心法提取的骨髄间充质干细胞来源的EV,符合国际鉴定标准qNano粒径分析显示囊泡颗粒直径大小分布于50-200nm,Western blot显示相较于细胞蛋白,所提取的MSC-EV表达丰富的EV特异蛋白指标CD9、TSG101,而表达较少内质网特异蛋白Calnexin。(2)MSC-EV可减轻SAH后脑组织病理损伤、脑水肿大鼠脑组织切片的HE染色、Nissl染色显示,SAH组发生明显的组织损伤改变,细胞固缩、染色加深不一;而相较于SAH组,SAH+EV组中细胞形态有明显改善,细胞形态更为饱满,发生固缩的细胞显著减少。宏观上利用干湿重法检测的全脑含水量结果显示,SAH大鼠明显较假手术组大鼠脑含水量更高,提示脑水肿发生,而间充质干细胞来源的EV明显改善了脑水肿情况。(3)MSC-EV能减轻SAH后神经功能损伤,并提高认知功能恢复采用改良的Garcia评分系统对大鼠进行神经功能评价,SAH组总评分显著低于Sham组,而在给予MSC来源的细胞外囊泡后,SAH+EV组相较于SAH组总评分有所提高。为进一步检测认知功能的恢复情况,在水迷宫实验中发现,间充质干细胞细胞外囊泡给药组大鼠表现明显好于PBS组,找到潜伏平台的时间更短,且在去除平台后,其穿越原平台位置及象限的次数也更多,提示其有更深的记忆形成。(4)MSC-EV可被神经元接受,并抑制神经元凋亡PKH67荧光标记的EV示踪实验显示,EV荧光信号主要存在于神经元中,同时,在肝脏、肾脏和脾脏中也有分布。另外,TUNEL染色显示,SAH后前额叶皮质和海马均有细胞凋亡产生,而MSC-EV能显著减少凋亡细胞数量。NeuN/Cas3免疫荧光双染显示,SAH后凋亡细胞主要为神经元,SAH+EV组凋亡神经元数量显著减少。而且,Western blot检测显示,SAH后前额叶皮质和海马组织中Bcl-2表达下调,Bax和活化的Caspase3表达上调,在给予MSC-EV的SAH大鼠中,Bcl-2的下调显著减弱,Bax和活化Caspase3的上调显著降低。4.结论(1)通过超速离心法能从MSC培养基上清中提取到符合国际鉴定标准的MSC来源的细胞外囊泡。(2)MSC-EV能够减轻SAH后脑组织病理损伤、脑水肿。(3)MSC-EV能减轻SAH后神经功能损伤,并提高认知功能恢复。(4)MSC-EV可被神经元接受,并抑制神经元凋亡。第二部分 miR-21介导的MSC-EV在SAH后的神经保护作用的分子机制研究1.目的(1)揭示MSC-EV对于SAH神经保护作用的分子机制。(2)结合测序和数据库,鉴定筛选MSC-EV中的关键治疗分子。(3)探究miR-21在大鼠SAH后的脑组织表达改变情况。(4)探究EV-miR-21在神经保护作用中的具体作用机制。2.方法1、MSC-EV的RNA高通量测序收集新鲜MSC培养基上清,超速离心法提取EV,抽提RNA,建库并上机测序。得到测序结果后,进行全面分析RNA种类及注释。2、SAH患者脑脊液miRNA结果分析及靶点筛选下载exRNA atlas数据库中SAH病人CSF miRNA测序数据,标注分组信息,记录miRNA表达情况,进而筛选潜在SAH相关miRNA。3、建立SAH时间梯度的动物模型,分为:Sham组、3h、6h、12h、24h、48h、72h和1周组,在规定时间点对前额叶皮质和海马组织分别取材,提取RNA并采用qPCR检测相关miRNA的表达。4、建立 SAH 大鼠模型,分组如下:Sham,SAH+PBS,SAH+MSC-EV,SAH+MSC-EV(-21)and SAH+MSC-EV+MK2206,MSC-EV(-21)为转染miR-21 inhibitor的MSC后所提取的EV,MK2206则通过立体定位注射以l00ug的剂量注入大鼠侧脑室。5、分离培养大鼠原代神经元,给予OxyHb处理,以进行SAH体外实验。采用qPCR检测神经元内和神经元分泌的EV中miR-21表达情况;进一步通过给予MSC-EV或EV分泌抑制剂GW4869,检测神经元EV中miR-21表达情况,并利用TUNEL技术检测凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白。6、SAH后48h,采用改良Garcia神经功能评分系统,对五组大鼠进行神经功能损伤评价。而后通过深度麻醉处死,取脑组织固定或提取蛋白。利用HE染色、TUNEL染色和NeuN/cleaved Caspase-3荧光染色检测神经元凋亡情况;采用Western blot技术对前额叶皮质和海马脑组织中凋亡相关分子进行检测。3.结果(1)miR-21在MSC-EV中表达丰度高,在SAH患者脑脊液中表达增多。RNA测序显示,MicroRNA在MSC-EV总RNA量中占重要比例,超过半数为成熟体形式。进一步分析,其中miR-21、miR-let-7i、let-7c等的表达丰度较高。结合exRNA atlas数据库的SAH患者CSF的miRNA表达结果,发现miR-21在SAH患者脑脊液中表达明显升高,提示miR-21参与了 SAH病理生理进程,而MSC-EV可能通过递送miR-21发挥了神经功能保护作用。(2)miR-21在SAH大鼠脑组织中表达反应性上调。在时间梯度的SAH大鼠模型中,qPCR结果显示前额叶皮质和海马脑区的miR-21表达量在SAH后发病后显著增高,但随着时间延长而减少,提示反应性升高的miR-21可能因外排而减少。同时,荧光原位杂交也显示miR-21在SAH大鼠的前额叶皮质中表达上调。(3)SAH后miR-21在神经元分泌的EV中上调,导致神经元凋亡增多。运用SAH体外模型,我们发现SAH能刺激神经元表达miR-21增多,同时EV中外排miR-21增多。GW4869、MSC-EV均能够提高神经元内的miR-21表达,并抑制神经元凋亡。(4)EV中的miR-21介导了 SAH后的神经保护作用。相较于SAH+EV组,SAH+MSC-EV(-21)组大鼠神经功能评分显著下降,TUNEL阳性细胞显著增多,凋亡神经元数量增多;Bc12表达下调、Bax、C-Cas3、PTEN表达上调。(5)miR-21通过PTEN/Akt轴促进神经元存活。MK2206抑制了 MSC-EV对于SAH大鼠的神经保护作用,使皮层神经元形态固缩严重,凋亡神经元数目显著增多,AKT磷酸化水平显著降低、Bc12表达下调、Bax表达上调、活化的Caspase3增多。4.结论(1)MiR-21-5p在间充质干细胞来源的EV中表达丰度高,且在SAH患者脑脊液中表达增多。(2)MiR-21-5p在SAH大鼠前额叶皮质和海马组织中表达反应性上调,二者高峰出现时间不同,但均在后期表达含量下降。(3)体外实验中,SAH后miR-21-5p在神经元分泌的EV中上调,抑制神经元外排miR-21-5p能促进神经元存活。(4)MiR-21-5p/PTEN/Akt通路介导了 MSC-EV对于SAH大鼠的神经保护作用。