【摘 要】
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目的:摸索适合于太子参ISSR的基因组DNA提取方法,筛选太子参ISSR引物,建立ISSR-PCR反应体系,检测太子参的ISSR分子标记,分析不同产地太子参的遗传关系,为太子参的遗传育种、品种改
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目的:摸索适合于太子参ISSR的基因组DNA提取方法,筛选太子参ISSR引物,建立ISSR-PCR反应体系,检测太子参的ISSR分子标记,分析不同产地太子参的遗传关系,为太子参的遗传育种、品种改良奠定理论基础。 方法:采用改良的CTAB法和非常规的尿素法两种方法对比提取太子参基因组DNA,运用单因素影响试验建立ISSR-PCR反应体系,通过NTSYS-pc version-2.11f计算机软件构建聚类树状图,对12个产地的太子参遗传关系进行分析。 结果:1.获得了适宜ISSR-PCR扩增的太子参基因组DNA提取的最佳方案。提取出的太子参基因组DNA其OD260/OD280在1.78~1.9范围内。找出一种全新的快速提取植物基因组DNA的方法——尿素法。 2.优化出了适于太子参的ISSR-PCR的最佳反应体系,即在20μl反应体系中,Mg2+浓度为37.5mmol/L,dNTPs浓度为0.25mmol/L,DNA模板浓度为30 ng,引物浓度为0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶的用量为2.5 U,10× Buffer为2.5μl。反应程序:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,37.9~70.1℃退火1min,72℃延伸2 min;35个循环;72℃继续延伸5min,4℃保温。获得了清晰、稳定的指纹图谱。 3.从18条ISSR引物中筛选出5条引物用于指纹图谱的构建。在ISSR-PCR试验中,共得到48条带,其中42条表现出多态性,占总带数的87.5%,太子参的多态位点百分率(PPB)在75%和100%之间。每条引物产生的位点数在8~12个之间。平均每个引物扩增的DNA带数为9.6条,大小介于200~1200bp之间。太子参各居群样品的相似系数在0.231~0.923之间。 4.根据UPGMA方法构建聚类树状图:12个产地的太子参分别聚为两大类:采自安徽省境内的宣州、亳州太子参和其他10个产地的太子参分别聚为两个大类。在10个产地的第二大类中,最先是来自同一个省份贵州的花溪、丹寨、施秉、黄平太子参聚到了一起,然后与来自江苏省的句容、江宁太子参相聚,再与附近的丹阳、潥阳太子参会合,最后与福建省柘荣太子参相聚,来自山东省临沭县的太子参居群在这第二大类聚类关系图的最外层。太子参12个居群的遗传距离在0.044~0.973之间,其中花溪和丹寨、花溪和黄平、花溪和江宁、施秉和丹寨的遗传距离最近为0.044,说明它们之间亲缘关系很近。句容和宣州遗传距离最远为0.973,说明它们之间的遗传变异程度大。 结论:太子参在遗传进化过程中,随着时空的变化、地理位置的变迁、气候的改变,基因组DNA发生了变异。ISSR分子标记可以有效地对太子参的遗传多样性进行分析。为太子参的的遗传育种、品种改良奠定理论基础。
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