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目的:卵巢癌是女性生殖系统肿瘤中死亡率最高的疾病,初诊者中70%的病例已属晚期,病变多已累及盆腹腔内的许多脏器,如大网膜的转移,肝脏的转移或肠系膜根部的转移等,晚期卵巢癌以腹腔广泛种植播散和大量腹水为主要临床特征。人正常腹腔微环境中存在大量免疫细胞尤其是巨噬细胞,巨噬细胞作为固有免疫的主要细胞成分对维持腹腔正常免疫环境有非常重要的作用。在卵巢癌腹腔种植播散的过程中,巨噬细胞与肿瘤细胞存在一定的相互作用,从而影响肿瘤细胞的恶性表型和不良转归。本课题拟通过检测不同分期卵巢癌患者腹腔巨噬细胞亚型,构架腹腔巨噬细胞体外模型,探讨腹腔巨噬细胞对卵巢癌的影响,来描述不同腹腔巨噬细胞亚型对卵巢癌恶性表型的不同影响,阐述卵巢癌腹腔播散和转移的免疫机制,为腹腔免疫微环境对卵巢癌的影响提供理论参考,为卵巢癌免疫治疗提供新的分子靶点和治疗思路,为解释卵巢癌的发生和发展提供新的线索,并为基于卵巢癌免疫治疗的干预策略提供理论基础。方法:1 用CD68、CD64、CD163分别标记巨噬细胞(M0)、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞,观察10例卵巢癌患者及17例卵巢良性肿瘤患者的腹水或腹腔冲洗液中M2/M1的比值。2 Ficoll密度梯度法分离健康成人外周血单个核细胞,GM-CSF诱导为巨噬细胞(M0),用对数生长期的SKOV3细胞培养上清液处理为实验组,用1640培养基处理为对照组,分别于培养第7天和第14天光学显微镜下观察巨噬细胞形态变化;流式细胞术检测实验组和对照组在不同时间后巨噬细胞表面细胞因子(CD64、CD163)表达情况。3 Ficoll密度梯度法分离健康成人外周血单个核细胞,GM-CSF诱导为巨噬细胞(M0),用对数生长期的SKOV3细胞培养上清处理14天,采用流式细胞术检测巨噬细胞亚型的改变及不同亚型细胞CD80、CD86和CD40的表达情况。4制作小鼠原位卵巢癌模型:用荧光素酶标记的SKOV3细胞悬液接种于BABL/cA-nu小鼠左侧肾下极脂肪垫内,制作小鼠原位卵巢癌模型,接种5只。分别在接种的第2、4周两个时间点检测小鼠腹水中M2/M1比值,并观察肿瘤的生长及转移情况情况。观察前每只小鼠腹腔注射荧光素底物(1.5Mg/10g),1%戊巴比妥麻醉后放入活体荧光影像系统摄像,slⅠdebook4.0软件进行分析。结果:1对照组M2/M1=0.75±0.31,Ⅰ+Ⅱ期M2/M1=2.14±0.37,Ⅲ+Ⅳ期M2/M1=3.01±0.45,Ⅲ+Ⅳ期患者腹水中M2/M1比值高于Ⅰ+Ⅱ期患者腹水中M2/M1比值,而Ⅰ+Ⅱ期M2/M1比值又高于对照组,每两组相比,p<0.05。2处理7天后,实验组巨噬细胞形态改变明显,细胞突起增加,细胞变细长,对照组细胞形态无明显变化;处理14天后,实验组巨噬细胞形态逐渐恢复,对照组细胞形态仍无明显变化。3流式细胞检测巨噬细胞亚型百分比,培养第7天时,实验组CD64-M1型巨噬细胞占(24.2±2.9)%,CD163-M2型巨噬细胞占(1.41±0.5)%,M1型巨噬细胞所占百分比较高;对照组CD64-M1型巨噬细胞占(15.4±2.3)%,CD163-M2型巨噬细胞占(2.05±0.7)%。培养第14天时,实验组CD64-M1型巨噬细胞占(1.88±0.9)%,CD163-M2型巨噬细胞占(11.5±1.4)%,M2型巨噬细胞所占百分比升高;对照组CD64-M1型巨噬细胞占(12.10±0.9)%,CD163-M2型巨噬细胞占(3.30±1.3)%。早期主要是Mo向CD64-M1型巨噬细胞分化,晚期主要是M0向CD163-M2型巨噬细胞分化,而对照组此种现象似乎不存在。每个时间点的两组相比,p<0.05,差异有统计学意义。4流式细胞检测巨噬细胞亚型比例,CD64-M1型巨噬细胞在第7天时M1/M0=1.61±0.29,在第14天时M1/M0=0.52±0.13;CD163-M2型巨噬细胞在第7天时M2/M0=0.73±0.19,在第14天时M2/M0=3.56±1.10;提示随着时间推移,M1/M0比值降低,而M2/M0比值升高,差异均有统计学意义(p<0.05)。5流式细胞术检测巨噬细胞表面细胞因子的表达情况,用SKOV3细胞培养上清培养巨噬细胞14天后,流式细胞学检测M1、M2中CD80、CD86和CD40的表达情况。(1)CD80在CD64-M1、CD163-M2上表达所占百分比分别为:(7.50±1.10)%、(6.60±0.98)%,两组比较,p>0.05,差异无统计学意义;(2)CD86在CD64-M1、CD163-M2上表达所占百分比分别为:(10.53±1.52)%、(10.30±1.50)%,两组比较,p>0.05,差异无统计学意义;(3)CD40在CD64-M1、CD163-M2上表达所占百分比分别为:(10.22±1.10)%、(2.50±0.32)%,两组比较,p<0.05,差异有统计学意义。可见CD40在CD163-M2型巨噬细胞的表达较CD64-M1型显著降低,而CD80、CD86的表达无明显改变。6小鼠原位卵巢癌模型:细胞接种BABL/cA-nu小鼠后,五只小鼠均有肿瘤生长,且4周时小鼠有明显的腹腔内播散及转移。五只小鼠腹水中M2/M1比值在接种2周时分别为1.45、1.58、1.66、1.32、1.78;接种4周时分别为3.25、3.78、2.68、4.02、3.17;各小鼠4周时M2/M1比值较2周时明显升高,差异有统计学意义(p<0.05)。五只小鼠荧光强度(*10^6)在2周时分别为2.85、1.86、1.58、2.31、1.06;4周时分别为6.32、5.52、4.87、5.78、3.88;各小鼠4周时荧光强度值均较2周时明显升高,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1上皮性卵巢癌患者腹水中有巨噬细胞浸润,早期患者M1型巨噬细胞所占比例较高,晚期患者M2型巨噬细胞所占比例较高,提示随着卵巢癌患者腹腔微环境的变化,由最初的M0主要向M1分化转变为M0向主要M2分化;M2型巨噬细胞比例较高提示卵巢癌患者期别较晚。2SKOV3细胞培养上清液可改变巨噬细胞形态,激活巨噬细胞免疫反应,随着时间的推移,细胞形态恢复,发生免疫抑制。3SKOV3细胞培养上清液可促进巨噬细胞分化,随着时间的推移,亚型也有不同,早期主要是Mo向CD64-M1型巨噬细胞分化,晚期主要是M0向CD163-M2型巨噬细胞分化,而普通1640培养基则无此变化。4SKOV3细胞培养上清刺激后的巨噬细胞向不同巨噬细胞亚型分化,M2型巨噬细胞较M1型巨噬细胞表面细胞因子分子表达下调,提示这些共刺激分子在巨噬细胞的活化及免疫应答过程中很重要,可能与肿瘤细胞的免疫逃逸有关。5小鼠原位卵巢癌模型说明,在卵巢癌的早期主要是M1型巨噬细胞,晚期主要是M2型巨噬细胞;M2型巨噬细胞可能有助于卵巢癌腹腔的播散及远处转移。