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甘露聚糖(Mannan)是一种广泛存在于植物体及微生物细胞壁中的半纤维素聚多糖,其性状无色、无毒、无异味。甘露聚糖不仅能有效地防止食品腐败变质、发霉和遭受虫害,并且其独特的生物活性能够刺激机体的免疫应答。因此甘露聚糖在食品和医药领域具有重要的应用前景。由于植物体甘露聚糖提取工艺复杂,后续使用物理化学法提纯存在诸多问题导致产品质量不稳定。而从微生物细胞壁中提取甘露聚糖产率低。这些因素导致了医药和食品级的甘露聚糖生产成本居高不下。随着生物技术的发展,以代谢工程和合成生物学手段改造微生物细胞合成代谢产物得到了快速发展。这为甘露聚糖的生物合成改造提供理论参考和技术基础。本论文的主要研究结果如下:(1)通过基因数据库查阅与筛选,对来源于瓜尔豆种子中的甘露聚糖合酶基因(ctmanS)进行密码子优化和基因合成,随后将其连接至大肠杆菌表达质粒pET21a,转入E.coli BL21(DE3)中,以100μg/μL的氨苄青霉素筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导30°C发酵48 h。分别优化了诱导剂IPTG浓度、碳源浓度和诱导温度对重组大肠杆菌产甘露聚糖的影响,得出最佳发酵条件为:IPTG浓度为0.4 mmol/L IPTG,葡萄糖浓度为20 g/L,诱导温度为37°C,在此条件下得出甘露聚糖产量约为0.69 g/L。(2)对Bacillus subtilis 168基因组信息分析比对,发现其缺乏甘露聚糖合成途径的磷酸甘露糖酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶和甘露聚糖合酶。因此,为了在枯草芽孢杆菌中重构甘露聚糖的合成途径将ctmanS基因克隆到E.coli-Bacillus subtilis穿梭整合载体pAX01上,然后经同源重组至Bacillus subtilis 168基因组上;将E.coli BL21(DE3)基因组来源的GDP-甘露糖焦磷酸化酶编码基因manC和磷酸甘露糖酶编码基因manB整合至枯草芽孢杆菌基因组上,获得重组菌株Bacillus subtilis 168M;将构建了甘露聚糖合成途径的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168M进行摇瓶发酵,测定重组菌株甘露聚糖产量为1.69 g/L,在此基础上分别优化了诱导剂浓度,碳源浓度和诱导温度,初步得出最佳摇瓶发酵条件为:诱导剂为10 g/L木糖,碳源为20 g/L葡萄糖,诱导温度为30°C时甘露聚糖产量达到最高为2.68 g/L。(3)为进一步考察上游途径基因manC,manB和manA对甘露聚糖合成的影响,构建了操纵子manC,manC-manB和manC-manB-manA,分别重组至枯草芽孢杆菌游离组成型质粒pP43NMK上,获得重组质粒pP43-C,pP43-CB和pP43-CBA。将上述三个重组质粒分别转入Bacillus subtilis 168M菌株中,分别获得重组菌株Bacillus subtilis 168M/pP43-C,Bacillus subtilis 168M/pP43-CB和Bacillus subtilis168M/pP43-CBA。以上述摇瓶培养条件,对4个重组菌株Bacillus subtilis 168M,Bacillus subtilis 168M/pP43-C,Bacillus subtilis 168M/pP43-CB和Bacillus subtilis168M/pP43-CBA进行摇瓶发酵培养,产量分别为2.67,3.12,2.99和4.21 g/L。结果表明上调manC和manA基因的表达水平,有助于提高甘露聚糖的产量,说明manC和manA两个酶是其合成的关键限速酶。本实验在食品级宿主枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168中构建了甘露聚糖合成途径,并通过对其合成途径上游基因的过表达分析获得了高效利用廉价葡萄糖为碳源生产甘露聚糖的工程菌株,重组菌株的甘露聚糖摇瓶发酵产量为4.21 g/L。