蛋白质或者多肽在某些条件下可产生淀粉样变性形成纤维,沉积于机体组织,造成器官及其功能损害。蛋白质淀粉样沉积是很多人类疾病的重要特征之一,大约有20多种疾病与相关的蛋白淀粉样变性有关,例如Aβ蛋白与阿尔兹海默症,α-突触核蛋白与帕金森氏疾病,以及溶菌酶与系统性淀粉样变性疾病等。目前这些疾病都还没有十分有效的治疗手段。迄今的大量研究表明,一些小分子化合物具有抑制蛋白质淀粉样纤维化和降解成熟纤维的作用,其中,天然黄酮类化合物的抗淀粉样变性作用受到了广泛的关注。黄酮类化合物是由2-苯基色原酮为母核而衍生的一类黄色色素,一般具有C6-C3-C6的基本骨架结构,其化学性质和生物活性主要由分子中的羟基数目、位置及其他官能团所决定。黄酮类化合物的抗淀粉样变性作用包括抑制淀粉样纤维的形成,解聚成熟的纤维结构,诱导纤维转变成无定型聚集体,从而降低纤维诱导的细胞毒性。黄酮类化合物抗纤维化的分子机制非常复杂,普遍认为它们以其完整分子的形式与多肽作用,进而抑制纤维的生长和解聚成熟的纤维,但是黄酮类化合物在生理条件下的易氧化特性通常被忽略。近年来的研究表明,一些黄酮类化合物在生理条件下可发生氧化,其生物效应不仅与其完整分子的结构有关,还与其氧化过程和氧化产物有关。为了系统地评估黄酮类化合物的抗蛋白淀粉样纤维化作用,本文选取槲皮素和与槲皮素结构相近的3种黄酮醇化合物(杨梅素、山柰酚、桑色素)以及所对应的四种二氢黄酮醇化合物(花旗松素、二氢杨梅素、香橙素、二氢桑色素)作为研究对象,对这些化合物的氧化行为进行分析,并采用溶菌酶作为模型蛋白,比较这些化合物氧化前后的抗纤维化作用,进一步对其构-效关系进行分析和总结。主要的实验方法和结果1、黄酮类化合物的稳定性采用高效液相色谱(HPLC)分析黄酮类化合物在不同pH条件下的氧化动力学,结果表明,在中碱性条件下,槲皮素、杨梅素、山柰酚、花旗松素、二氢杨梅素、香橙素六种黄酮不稳定,其半衰期与B环上的羟基数目和位置、C环上的双键结构有关。相对而言,B环具有间酚结构的桑色素和二氢桑色素较为稳定。2、溶菌酶纤维生长动力学采用硫黄素T(ThT)荧光检测溶菌酶纤维的生长过程,8-苯胺基-1-苯磺酸钠(ANS)荧光分析纤维化过程中溶菌酶分子表面疏水结构的变化,圆二色谱法(CD)分析溶菌酶纤维的二级结构,透射电子显微镜(TEM)表征各种情况下形成的蛋白聚集体形貌。结果表明,溶菌酶在形成淀粉样纤维的过程中,分子的β-折叠增加,α-螺旋减少,分子内部疏水区域外露,最终组装成为典型的纤维形态。3、黄酮类化合物及其氧化产物对溶菌酶纤维化的影响采用上述溶菌酶纤维化体系,对黄酮醇和二氢黄酮醇及其氧化产物抑制纤维生长的作用进行比较。结果显示,所有黄酮类化合物对纤维的生长都具有一定的抑制作用,黄酮醇化合物的抑制能力强于二氢黄酮醇化合物,且它们的氧化产物的抑制效果强于其完整分子,其抗纤维化作用与黄酮类化合物B环的羟基位置和数目有关。其中,B环上拥有邻三酚结构的杨梅素及其氧化产物是抑制作用最强的化合物。4、黄酮类化合物及其氧化产物对成熟溶菌酶纤维的降解在成熟的溶菌酶纤维中分别加入黄酮类化合物及其氧化产物,采用ThT荧光、Bradford法和TEM等手段检测纤维的降解。结果表明,黄酮类化合物对成熟的溶菌酶纤维均具有一定的降解作用,降解纤维的能力与B环上羟基的位置和数量有关,羟基数目越多,分子对纤维的降解能力越强;邻位羟基比间位羟基所对应的黄酮醇化合物降解能力更强;氧化后的黄酮类化合物对纤维的降解效果更好。5、黄酮类化合物与溶菌酶分子的相互作用分析为了更深入地从分子机制上理解黄酮类化合物的抗溶菌酶淀粉样纤维化作用,本文还采用了内源荧光和模拟分子对接技术对黄酮与蛋白分子的相互作用进行了分析。内源荧光结果显示,黄酮对蛋白质荧光具有猝灭作用,猝灭作用与抗纤维化作用呈正相关,表明二者形成了稳定的复合物。根据分子对接所得到的复合物结构,黄酮类化合物通过嵌合到溶菌酶分子疏水腔的形式实现对接,两者间的主要作用力是氢键和范德华力。结合能越大,黄酮分子与蛋白质形成的复合物越稳定,其抗纤维化作用越强。结论本文选取8种结构相似的黄酮类化合物,对这些化合物在不同pH条件下的稳定性、完整分子及其氧化产物的抗纤维化作用进行了检测和比较。结果表明,这些黄酮类化合物均具有一定的抗溶菌酶纤维化作用,氧化后作用更强。黄酮类化合物的氧化速率与其B环中羟基的位置和数目有密切联系,具有邻二酚和邻三酚的黄酮较易氧化,间酚结构的黄酮比较稳定。黄酮类化合物的抗纤维化作用也与其结构有关,B环上具有邻二酚和邻三酚的化合物表现出较强的抗纤维化作用,而C环上2、3位具有双键的黄酮的作用更强。黄酮类化合物与溶菌酶分子结合形成复合物,复合物越稳定,其抗纤维化作用越强。本文首次系统地探索了黄酮化合物的稳定性及其抗纤维化作用,发现黄酮化合物在氧化后,抗纤维化作用增强。该结果为寻找更为有效的淀粉样纤维化疾病治疗药物提供了新的途径,相关的作用机制还需要进一步探索。