目的:口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinomas OSCC)是一种起源于口腔粘膜上皮的头颈部最常见的恶性肿瘤,发病率约占口腔颌面部恶性肿瘤的80%以上,位列全身恶性肿瘤的第八位。口腔鳞状细胞癌常发展迅速,早期可向区域淋巴结转移,晚期可发生远处转移,严重影响患者生活质量,甚至威胁生命。尽管随着多学科综合序列治疗模式的引入使治疗取得了一定程度上的突破,但患者术后五年的存活率仍维持在50%。因此,深入研究口腔鳞状细胞癌发生发展的分子机制,探索有效的生物标志物以及治疗靶点,对于口腔鳞状细胞癌的预防、控制和治疗具有重要的临床意义。BNIP3(BCL2/adenovirusElB19kd-interacting protein 3)是一种能与腺病毒ElB19kD蛋白相互结合的促调亡蛋白,在多种肿瘤的发生发展中扮演着重要角色,缺氧条件下BNIP3基因可以诱导程序性细胞死亡或凋亡。近来研究发现BNIP3还可使得细胞发生自噬。microRNA(miRNA)是一类大小约17～25nt的小分子非编码RNA,通过与靶基因mRNA的3’-UTR结合,降解或者抑制mRNA的翻译,实现对靶基因的负调控。多项研究证实,miRNA的异常表达与多种癌症发生相关,它可调控癌症相关基因,参与肿瘤细胞增殖、侵袭、凋亡或血管形成等过程,起到类似于癌基因或者抑癌基因的作用,成为肿瘤诊治中新的研究方向。miR-150是miRNA家族中重要的一员,研究发现miR-150在多种肿瘤中异常表达,且miR-150的异常表达影响到肿瘤细胞的增殖、迁移及凋亡等生物学功能。我们通过生物信息学方法分析发现在口腔鳞癌中,miR-150和BNIP3表现负性相关,提示两者之间可能存在靶向调控关系,但仍需相关的实验证据去证实。本研究旨在探讨BNIP3在口腔鳞癌中的表达情况、可能的分子调节机制以及在口腔鳞癌细胞中的生物学作用,为临床治疗提供新的思路及依据,共分以下三部分。第一部分:应用Western Blot和荧光定量PCR方法,在细胞和组织水平上检测BNIP3与miR-150在口腔鳞癌中的表达水平,分析miR-150与BNIP3的相关性。第二部分:构建稳定过表达、沉默表达miR-150细胞株,观察miR-150对CAL-27细胞侵袭等生物学行为的影响,揭示miR-150在口腔鳞癌发生发展中的作用,为口腔鳞癌的早期诊断及靶向治疗提供参考依据。第三部分:Western Blot分析miR-150表达改变对BNIP3蛋白的调控作用,并在体外实验中研究miR-150对口腔鳞癌细胞自噬水平的影响,初步探讨miR-150在口腔鳞癌细胞内调控自噬的分子机制,为口腔鳞癌的分子治疗提供新的靶点。方法:1.运用实时荧光定量PCR技术,分别检测暴露在正常氧(20%O2)和低氧(1%02)条件下的口腔鳞癌细胞CAL-27及配对的8例口腔鳞癌组织和癌旁正常组织样本(n=8)中内源性miR-150和BNIP3的mRNA表达水平,并利用Spearman分析miR-150的表达与BNIP3是否存在相关性。2.利用Western Blot方法,分别检测暴露在正常氧(20%O2)和低氧(1%O2)条件下的口腔鳞癌细胞CAL-27及配对的8例口腔鳞癌组织和癌旁正常组织样本(n=8)中内源性BNIP3的蛋白表达水平。3.采用锐博公司的转染试剂riboFECTTMCP Reagent,向CAL-27细胞中瞬时转染不同终浓度miR-150 mimic和miR-150 inhibitor,建立稳定过表达、沉默表达miR-150细胞株,转染48h后用荧光定量PCR检测miR-150的转染效率,鉴定并筛选效果最佳处理浓度,用于后续实验研究。4.运用细胞划痕实验、Transwell迁移实验及Transwell侵袭实验等方法检测过表达和沉默表达miR-150对口腔鳞癌细胞CAL-27迁移和侵袭的影响。5.建立体外低氧培养的口腔鳞癌细胞模型,模拟肿瘤低氧微环境,CAL-27细胞低氧(1%O2)暴露4h,8h,16h,24h后,通过细胞免疫荧光法检测自噬小体荧光颗粒的聚集;透射电镜观察自噬小体结构的数量;Western Blot检测细胞中表达自噬蛋白 BNIP3、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin-1和 P62 的变化。6.采用 miR-150 mimic 和 miR-150 inhibitor 瞬时转染 口腔鳞癌细胞 CAL-27,应用Western Blot、细胞免疫荧光和细胞电镜方法,验证在低氧条件下miR-150对口腔鳞癌细胞自噬的影响。7.miR-150 mimic 和 miR-150 inhibitor 转染 CAL-27 细胞,48h 后通过 Western Blot检测BNIP3蛋白的表达变化,验证miR-150对低氧条件下的CAL-27细胞中BNIP3有负调控作用。结果:1.miR-150在癌组织中的表达水平显著低于癌旁正常口腔组织(P<0.05);低氧(1%O2)条件下的miR-150表达水平较正常氧(20%O2)组显著下调(P<0.05),以癌旁正常口腔组织的平均值作为对照,miR-150在CAL-27细胞中(1%O2)的表达水平显著低于8例正常口腔组织中miR-150表达的平均值(P<0.05)。2.相对于正常氧(20%O2)组,BNIP3 mRNA在低氧(1%02)条件中表达显著上调(P<0.05),BNIP3 mRNA在癌组织中的表达水平亦显著高于癌旁正常口腔组织(P<0.05),以癌旁正常口腔组织的平均值作为对照,BNIP3mRNA在CAL-27细胞中(1%O2)的表达水平显著高于8例正常口腔组织中BNIP3 mRNA表达的平均值(P<0.05)。Western Blot结果显示BNIP3的蛋白表达与mRNA表达情况趋势相同。3.Spearman相关分析显示在配对的8例口腔鳞癌组织和癌旁正常组织中miR-150的表达水平与BNIP3的表达存在负相关(r=-0.482,P<0.01)。4.荧光定量PCR结果显示,转染终浓度100 nmol/L miR-150 mimic组CAL-27细胞miR-150表达最高(P<0.01),因此,选择100nmol/L作为本实验miR-150 mimic 的处理浓度;转染终浓度 50 nmol/L miR-150 inhibitor 组 CAL-27细胞miR-150表达最低(P<0.01),因此,选择50nmol/L作为本实验miR-150 inhibitor的处理浓度,用于后续实验研究。5.划痕实验结果显示,转染miR-150 mimic的CAL-27细胞迁移速度明显慢于对照组,其24h的迁移率分别为(14.28±2.46)%和(42.86±8.31)%,结果有显著性差异(P<0.05);而转染miR-150 inhibitor的CAL-27细胞迁移速度明显快于对照组,其24h的迁移速度分别为(64.28±9.73)%和(35.71±2.59)%,结果有显著性差异(P<0.05),表明过表达miR-150能在体外抑制口腔鳞癌细胞CAL-27的迁移能力。6.Transwell迁移实验结果显示,转染miR-150 mimic的CAL-27细胞24h后的穿越Transwell膜的细胞数(32± 12)较对照组(81 ± 13)明显减少,差异具有显著统计学意义(P<0.05);而转染 miR-150 inhibitor 的 CAL-27 细胞 24h 穿越 Transwell膜的细胞数(173± 15)较对照组(95± 11)明显增加,差异具有显著统计学意义(P<0.05),表明过表达miR-150能在体外抑制口腔鳞癌细胞CAL-27的迁移能力。7.Transwell侵袭实验显示,铺胶24h后,转染miR-150mimic的CAL-27细胞24h后的穿透基质胶的细胞数(35±09)较对照组(97±32)明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);而转染miR-150inhibitor的CAL-27细胞24h穿透基质胶的细胞数(195±29)较对照组(99±25)明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),表明过表达miR-150能在体外抑制口腔鳞癌细胞CAL-27的侵袭能力。8.口腔鳞癌细胞CAL-27暴露低氧(1%O2)环境4h、8h、16h、24h后,CAL-27细胞自噬激活,随低氧暴露时间延长呈上升趋势。在自噬模型中,Western Blot结果显示,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、BNIP3、Beclin-1表达上调,p62蛋白的表达降低;荧光显微镜观察细胞自噬小体荧光颗粒的聚集、透射电镜观察自噬泡和自噬小体数量均较低氧暴露前明显增加(P<0.05)。9.CAL-27细胞转染miR-150 inhibitor低氧(1%O2)条件24h后,荧光显微镜观察细胞自噬小体荧光颗粒的聚集、透射电镜观察白噬泡和自噬小体数量相对于对照组(negative control),均明显增加(P<0.05),提示自噬水平增强;而转染miR-150 mimic 24h后,荧光显微镜观察细胞自噬小体荧光颗粒的聚集、透射电镜观察自噬泡和自噬小体数量相对于对照组(negative control),均明显减少(P<0.05),提示自噬水平减弱。10.低氧(1%O2)条件CAL-27细胞转染miR-150 mimic 48h后,BNIP3蛋白表达量明显低于对照组(P<0.05);相反,转染miR-150 inhibitor的CAL-27细胞48h后,BNIP3蛋白表达量明显高于对照组(P<0.05),提示miR-150对低氧条件下的CAL-27细胞中BNIP3有负调控作用。结论:miR-150在口腔鳞癌组织和低氧暴露的CAL-27细胞中低表达,BNIP3在口腔鳞癌组织和低氧暴露的CAL-27细胞中高表达,miR-150与BNIP3的表达存在负相关;miR-150的过表达能够显著抑制口腔鳞癌细胞CAL-27迁移及侵袭;miR-150通过负向调控CAL-27细胞内BNIP3的蛋白表达抑制口腔鳞癌细胞自噬。