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第一部分原发性TRAIL耐受机制的研究目的：验证两种肺癌细胞A549与H460对TRAIL敏感性的差异,分析A549和H460细胞死亡受体的表达水平与TRAIL敏感性的关系,探讨DR4的基因表达抑制对A549细胞TRAIL敏感性的影响,检测两种肺癌细胞TRAIL所诱导的死亡受体向膜脂筏区重分布水平的差异,验证死亡受体向膜脂筏区聚集的功能与肺癌细胞的TRAIL敏感性有关。方法：MTT法分别检测TRAIL对A549与H460细胞的药物毒性,流式细胞学方法检测TRAIL所诱导的细胞凋亡水平。RT-PCR与western blot分别检测A549与H460细胞中死亡受体DR4与DR5的表达水平。根据DR4序列设计相应的siRNA,转染至A549细胞内,RT-PCR与western blot验证DR4的基因表达抑制。MTT法与流式细胞学方法分别检测DR4基因表达抑制的A549细胞的TRAIL敏感性。免疫荧光染色结合流式细胞术检测TRAIL所诱导的死亡受体膜聚集水平。密度梯度超速离心法分离脂筏与非脂筏成分后,通过western blot检测TRAIL所诱导的DR4、DR5,以及pro-caspase8在两种肺癌细胞中向脂筏区重分布水平的差异。制霉菌素预处理TRAIL敏感的H460细胞,干扰其脂筏功能,反向验证死亡受体向膜脂筏区转运的功能与TRAIL敏感性相关。结果：MTT法与流式细胞学方法均验证了A549为原发性TRAIL耐受的肺癌细胞,H460为TRAIL敏感的肺癌细胞。RT-PCR与western blot检测发现：两种细胞的DR5表达水平相似,原发性TRAIL耐受的A549细胞反而具有更高的DR4表达水平。DR4-siRNA的转染成功抑制了A549细胞的DR4基因的表达。但MTT与流式细胞学结果显示：DR4基因的表达抑制对A549的TRAIL敏感性并未产生明显影响。免疫荧光染色结合流式细胞术发现：随着TRAIL诱导时间的延长,H460细胞膜表面含TRAIL的免疫复合物水平明显升高,而A549细胞无类似现象。密度梯度超速离心法分离脂筏与非脂筏成分后,caveolin-1被检测位于条带4、5处,证实该处为脂筏所在的位置,H460细胞经TRAIL处理后,死亡受体DR4与DR5,以及pro-caspase8向脂筏区移动,而A549细胞无此趋势。制霉菌素有效地抑制了死亡受体向膜脂筏聚集,导致了原来敏感的H460细胞对TRAIL所诱导的凋亡水平明显下降。结论：非小细胞肺癌A549细胞为TRAIL原发性耐受细胞,H460细胞为TRAIL敏感细胞。死亡受体的表达水平与肺癌细胞的TRAIL敏感性无明显正相关性,且DR4的表达水平在A549细胞的TRAIL原发性耐受中无关键作用。TRAIL所诱导的死亡受体向膜脂筏区的转运调节功能与肺癌细胞的TRAIL敏感性密切相关,A549细胞的原发性TRAIL耐受可能与死亡受体向脂筏区重分布的功能缺陷有关。第二部分获得性TRAIL耐受细胞株H460R的建立与鉴定目的：建立获得性TRAIL耐受的非小细胞肺癌细胞株H460R,验证亲本株H460细胞与耐药株H460R细胞的TRAIL敏感性的不同,检测H460R细胞对顺铂的治疗反应性是否发生变化。方法：我们以TRAIL敏感的非小细胞肺癌H460细胞为基础,通过无限稀释克隆形成实验和低浓度TRAIL诱导,建立获得性TRAIL耐受细胞模型H460R；使用含不同浓度rhTRAIL的完全培养基分别对H460与H460R细胞进行孵育,显微镜下直接观察细胞形态、CCK-8法检测药物对细胞的毒性、流式细胞术检测药物所诱导的细胞凋亡水平,验证H460R细胞的TRAIL耐药性；并采用CCK-8法检测两种细胞的顺铂剂量存活曲线。结果：成功建立了获得性TRAIL耐受的非小细胞肺癌细胞株H460R。光学显微镜下观察：未经任何因素处理的H460R细胞与H460细胞具有相同的细胞形态；经不同浓度的TRAIL处理后,H460细胞表现为TRAIL敏感细胞,而H460R细胞表现为TRAIL耐药。CCK-8试验检测TRAIL对两种细胞的毒性：随着TRAIL处理浓度的上升,H460与H460R细胞的存活率呈剂量依赖性均有所下降,但H460细胞的下降幅度更大,其中,H460的IC50约为50ng/ml,而H460R的IC50约为250ng/ml。同时,H460与H460R未经TRAIL处理时,其凋亡率无明显差异；给予50ng/ml TRAIL处理4小时后,H460的凋亡率明显高于H460R,并具有统计学意义。说明H460R获得性耐药细胞模型建立成功。最后,H460与H460R细胞经不同浓度的顺铂处理后,其细胞存活率相似,两者的剂量存活曲线几乎重合。结论：成功建立了获得性TRAIL耐受的非小细胞肺癌细胞株H460R；从形态学上验证了H460与H460R细胞具有相同的遗传背景；鉴定H460R为获得性TRAIL耐受细胞株；验证了H460R细胞仅对TRAIL耐受,对直接作用于细胞DNA的化疗药物顺铂未发生同样的耐药。第三部分获得性TRAIL耐受机制的研究目的：探讨获得性TRAIL耐受的H460R细胞死亡受体的表达水平与其亲本株H460细胞相比是否发生变化,分析死亡受体DR4与DR5表达水平的变化对H460与H460R细胞的TRAIL敏感性的影响,检测TRAIL所诱导H460与H460R细胞的死亡受体向膜脂筏区重分布水平的差异,验证死亡受体向膜脂筏区聚集功能的缺陷与肺癌细胞发生获得性TRAIL耐受有关。方法：RT-PCR与western blot分别检测H460与H460R细胞中死亡受体DR4与DR5的表达水平。根据DR4/DR5序列构建相应的过表达重组质粒、根据DR4/DR5序列设计相应的siRNA,并分别转染至H460与H460R细胞中,RT-PCR法验证基因的过表达或沉默效率,CCK-8与流式细胞学方法检测其TRAIL敏感性的变化。间接免疫荧光染色法结合流式细胞术检测TRAIL所诱导的死亡受体膜聚集水平在H460R及其亲本株H460细胞中的差异。密度梯度超速离心法分离脂筏与非脂筏成分后,通过western blot检测TRAIL所诱导的DR4/DR5,以及pro-caspase8在脂筏区重分布的差异。免疫荧光双染色后共聚焦显微镜下观察TRAIL处理前后死亡受体在H460与H460R细胞中的定位与分布。制霉菌素预处理TRAIL敏感的H460细胞,干扰其脂筏功能,验证死亡受体在膜脂筏区转运功能的缺陷与获得性TRAIL耐受之间的相关性。结果：获得性TRAIL耐受的H460R细胞与H460细胞死亡受体的mRNA与总蛋白的表达水平相同,且TRAIL预处理并不影响死亡受体的mRNA与总蛋白的表达水平。CCK-8与流式细胞学结果显示：死亡受体过表达的H460与H460R细胞,TRAIL敏感性上升,反之,死亡受体表达沉默的细胞,TRAIL敏感性下降。间接免疫荧光染色结合流式细胞术发现：随着TRAIL诱导时间的延长,H460细胞的死亡受体的膜表达升高,而获得性TRAIL耐受的H460R细胞无类似现象。密度梯度超速离心法分离脂筏与非脂筏成分后：caveolin-1被检测位于条带4、5处,证实该处为脂筏所在的位置,H460细胞经TRAIL处理后,死亡受体DR4与DR5,以及pro-caspase8向脂筏区移动,而获得性TRAIL耐受的H460R细胞无此趋势。共聚焦显微镜下直接观察死亡受体在膜脂筏区的定位情况再次验证了前面的结果。最后,制霉菌素有效地抑制了死亡受体向膜脂筏聚集,导致了原来敏感的H460细胞对TRAIL所诱导的凋亡水平明显下降。结论：获得性TRAIL耐受的H460R细胞与其亲本株H460细胞具有相同的死亡受体表达水平,且TRAIL预处理不影响两种细胞死亡受体的表达水平。死亡受体的过表达与沉默试验验证了其表达水平是TRAIL所诱导的细胞凋亡的必要条件。死亡受体向膜脂筏区转运调节的功能与肺癌细胞的TRAIL敏感性密切相关,H460R细胞发生获得性TRAIL耐受可能与死亡受体向脂筏区重分布功能的缺陷有关。