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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiration syndrome, PRRS),是由PRRSV引起的一种急性高度传染性的疾病,虽然科学家在防控方面已经做了大量的工作,仍然是危害生猪养殖业的重大疫病之一,给全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。目前控制PRRSV的主要措施包括生产管理因素、后备母猪适应策略和疫苗免疫等,但对这种极具破坏力的疾病以上措施还是不能满足生猪养殖业的需要,因此为更好地控制该病在猪群中的发生与流行,对PRRSV的致病机制、免疫逃避机制等进行更深入研究的基础上,应寻求更好更有效的PRRSV防治措施。本文利用Bac-to-Bac表达系统表达了猪SPA/Ficolin和PA-Ficolin/SPA两类四种蛋白,以抗病毒药物和PRRSV纯化为出发点,探索了猪SPA的抗PRRSV作用及GEM-PA-Ficolin/SPA体系对PRRSV细胞毒的浓缩纯化技术,旨在为PRRSV的防控提供一个更好的研究方向。1.利用Bac-to-Bac系统表达猪SPA/Ficolin和PA-Ficolin/SPA两类四种蛋白本研究采用Bac-to-Bac系统进行猪SPA/Ficolin和PA-Ficolin/SPA两类四种蛋白的表达。利用Primer Premier 5.0设计特异性引物,为方便目的蛋白的纯化和检测,引物中引进了His-Tag,以实验室已构建好的含有猪SPA、Ficolin和锚钩PA基因的重组质粒为模板,进行PCR扩增,获得的PCR产物克隆至PMD-18T载体,双酶切鉴定正确后进行测序分析,将鉴定为正确的阳性质粒命名为18T-Ficolin、18T-SPA和18T-PA。利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ分别对18T-Ficoln、18T-SPA和pFastBac1转移载体进行酶切,利用T4 DNA连接酶分别进行目的片段与pFastBac1转移载体的连接,然后将连接产物转化至DH5α感受态细胞,得到重组转移载体pFast-SPA和pFast-Ficolin;为节省时间重组转移载体pFast-PA-SPA和pFast-PA-Ficolin的制备采用三组份一步连接法,具体步骤如下：利用限制性内切酶对杆状病毒转移载体质粒和含有目的基因的重组质粒进行双酶切,利用T4 DNA连接酶进行SPA、PA和pFastBacl的连接及Ficolin、PA和pFastBac1的连接,然后转化,得到重组转移载体pFast-PA-Ficolin和pFast-PA-SPA。重组转移载体pFast-SPA/pFast-Ficolin、pFast-PA-SPA/pFast-PA-Ficolin和pFastBac1分别转化含有穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞,经三轮蓝白斑筛选及PCR鉴定获得重组Bacmid即：rBacmid-SPA、rBacmid-Ficolin、rBacmid-PA-SPA、rBacmid-PA-Ficolin和rBacmid-pFast,同时挑取蓝斑得到野生型Bacmid。上述Bacmid转染sf9细胞,收获培养上清,利用通用引物M13F/R进行PCR鉴定,鉴定正确的说明转染成功,得到的重组毒命名为rBV-SPA、rBV-Ficolin、rBV-PA-SPA、 rBV-PA-Ficolin、rBV-pFast及野生型杆状病毒BV。扩繁后进行蛋白表达。Western Blotting结果说明除Ficolin外,SPA和PA-Ficolin/SPA三种蛋白都能进行可溶性表达,可以用于后续研究。其中猪SPA还需要进行纯化、脱盐、除菌等操作获得高纯度的目的蛋白进行抗病毒的研究。2.重组猪SPA的表达及其抗病毒活性和作用机制初探关于凝集素抗微生物的研究,在人医领域研究较多,在兽医领域研究相对较少,而关于动物凝集素抗PRRSV的研究资料非常有限。本研究表明重组猪SPA (RpSPA)能够显著降低PRRSV在Marc-145上的感染,30 μg·mL-1 RpSPA使蚀斑减少77%,15 μg·mL-1 RpSPA使蚀斑减少43%,呈现出一定的剂量依赖性,同时能够降低PRRSV总RNA及总蛋白水平,并且SPA具有钙离子依赖性,提示SPA中和PRRSV的作用可能是由其碳水化合物结构域介导的。进一步研究发现RpSPA主要通过抑制PRRSV吸附于Marc-145细胞而发挥抗病毒作用,对病毒内化的作用较弱,且随着RpSPA加入时间的延迟抑制效应逐渐降低,提示病毒进入细胞后RpSPA则不能发挥作用；Real-Time qPCR结果显示病毒只进行一个复制周期时,RpSPA对PRRSV总RNA水平没有影响,而病毒进行多个复制周期时却导致PRRSV总RNA水平显著下降,提示RpSPA可能作用于释放的子代病毒,使其丧失继续感染细胞的能力。研究显示PRRSV表面糖蛋白能够介导病毒的入侵,RpSPA很可能通过与PRRSV表面的糖蛋白GP2、GP3、GP4或GP5中的一种或几种结合,从而阻断了病毒入侵途径,然而由于对靶细胞、PRRSV及RpSPA之间相互作用的了解还不十分清楚,上述作用机制模式还需要进一步的研究加以验证。3.构建GEM-PA-Ficolin/SPA病毒纯化体系本研究的GEM纯化体系的设计构想为：首先GEM颗粒与具有锚定功能的融合蛋白,即锚钩蛋白PA-凝集素(Ficolin或SPA),进行结合,然后利用凝集素对PRRSV的特异性结合而实现病毒纯化。具有锚定作用的融合蛋白的设计是本研究中实现病毒纯化的关键,本研究采用Bac-to-Bac表达系统制备的PA-Ficolin/SPA具有预想的功能,即通过PA与GEM的特异性结合使融合蛋白展示在GEM颗粒表面,同时通过凝集素Ficolin/SPA与PRRSV的特异性结合使PRRSV也结合在颗粒上,另外,Ficolin/SPA的微生物结合谱比较广泛,还可以与HIV, HCV, AIV等结合,提示不仅可以纯化PRRSV,还可以纯化所有可以与SPA和Ficolin结合的病毒。说明本研究建立的病毒纯化体系具有广泛的应用。