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研究一 基于斑马鱼模型的TYRO3功能鉴定目的:确定TYRO3在肾脏上的表达及tyro3在斑马鱼足细胞中的功能鉴定。方法:(1)应用免疫荧光双套色及激光共聚焦显微镜,观察TYRO3在人肾小球中细胞定位;免疫组化检测TYRO3在糖尿病肾病患者(DN)中的表达变化;(2)体内实验应用tyro3 morpholino及CRISPR/Cas9基因编辑技术实现斑马鱼tyro3的敲低及tyro3基因全身敲除通过水肿率、蛋白尿实验及电镜观察tyro3敲低对斑马鱼肾小球滤过膜和足细胞的影响。结果:(1)免疫荧光双套色的结果显示,肾小球中TYRO3与足细胞标记分子SYNAPTOPODIN共表达,而与内皮细胞标记分子CD31以及系膜细胞标记分子GATA3没有共定位关系;(2)免疫组化结果显示,TYRO3和磷酸化TYRO3在糖尿病肾病患者和db/db小鼠肾小球中表达水平均较正常对照显著降低;(3)人TYRO3蛋白序列与斑马鱼tyro3蛋白序列比对相似性达47%;分离斑马鱼肾小球的RT-PCR结果显示tyro3在斑马鱼肾小球上表达;(4)利用tyro3 morpholino有效的实现了斑马鱼tyro3的敲低;tyro3的敲低导致斑马鱼斑出现眼周、卵黄囊及心包水肿表型;肾小球对荧光标记70KD葡聚糖的滤过率显著增加,显示肾小球滤过膜受损;电镜结果显示足突融合;恢复(rescue)实验结果显示,tyro3 morpholino联合tyro3 mRNA注射的斑马鱼,斑马鱼水肿和足突融合的表型消失;(5)CRISPR/Cas9基因编辑技术有效的对斑马鱼tyro3造成了碱基的敲除;tyro3基因敲除斑马出现了水肿和足突融合。结论:在肾小球上TYRO3特异性表达于足细胞;糖尿病肾病患者肾活检组织中TYRO3表达水平显著低于正常人;抑制TYRO3可致斑马鱼肾小球滤过屏障受损;tyro3在斑马鱼足细胞稳态维持中发挥重要作用。研究二 足细胞TYRO3调控机制研究目的:利用体外培养人足细胞观察损伤刺激后TYRO3的表达变化以及改变TYRO3的表达后对足细胞功能的影响,进一步探讨TYRO3在足细胞正常功能维持的分子机制。方法:(1)利用免疫组化检测TYRO3配体GAS6和PROS1在人肾小球上的表达;(2)高糖和TGF-β处理人足细胞后用qRT-PCR和Western Blot检测TYRO3的表达变化;(3)用TYRO3 siRNA抑制人足细胞TYRO3表达;流式细胞术分析凋亡;鬼笔环肽骨架染色观察骨架情况;(4)抑制和过表达体外培养足细胞TYRO3的表达,Western blot检测TYRO3相关下游信号通路磷酸化水平变化;(5)Western blot检测足细胞TYRO3改变和损伤刺激下足细胞p53的表达变化;(6)荧光素酶报告基因实验检测TYRO3对p53启动子活性影响。结果:(1)免疫组化结果显示TYRO3配体GAS6和PROS1在肾小球上都有表达;(2)高糖和TGF-β处理足细胞后,qRT-PCR和Western Blot检测TYRO3的表达明显降低;(3)抑制TYRO3表达诱导足细胞凋亡增加,骨架受损;(4)Western Blotde结果显示,抑制体外培养足细胞TYRO3的表达会导致JNK MAPK通路抑制,而p38 MAPK通路活化;过表达足细胞TYRO3会导致JNK MAPK通路活化而p38 MAPK通路抑制;(5)TYRO3抑制p53的表达,损伤刺激下足细胞p53表达增加;(6)荧光素酶报告基因实验显示TYRO3抑制p53启动子活性,阻断JNK后p53启动子活性恢复。结论:高糖和TGF-β可以降低足细胞TYRO3的表达;TYRO3表达降低诱导足细胞凋亡、骨架损伤;TYRO3表达改变导致p38和JNK磷酸化水平改变;TYRO3对p53的抑制通过JNK信号通路介导。