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研究背景：膀胱癌是人类的多发病和常见病,全世界范围内膀胱癌发病率有逐年增加的趋势。流行病学的研究提示膀胱癌的发生受到很多环境因素的影响,其中就包括通过饮用咖啡等途径对咖啡因的摄入,过量摄入咖啡因可增加发生膀胱癌的危险性。但咖啡因又是世界范围内消耗最大、应用最广泛的一种神经刺激物,由于人口基数很大,如果咖啡因确实能引起膀胱癌的发生和发展,那么对整个人群健康就会产生重大的影响。因此,对咖啡因与膀胱癌之间究竟是何关系及可能的影响机制进行深入的研究就显得十分的必要。第一部分研究咖啡因(caffeine)对p53野生型RT4膀胱癌细胞凋亡的影响研究目的：应用MTT及流式细胞技术,观察咖啡因(caffeine)、离子射线(IR)和两者联合应用对p53野生型RT4膀胱癌细胞产生的反应,以了解咖啡因对膀胱癌细胞凋亡的影响。材料和方法：1.RT4膀胱癌细胞的培养。2.细胞分组及处理。3.单纯IR对RT4膀胱癌细胞增殖活性的影响(MTT法)。4.IR联合咖啡因对RT4膀胱癌细胞增殖活性的影响(MTT法)。5.流式细胞技术检测细胞的凋亡6.统计学分析。结果：1.IR促进了体外培养的RT4膀胱癌细胞株的凋亡。2.咖啡因能降低IR对RT4膀胱癌细胞的杀伤作用。结论：1.IR照射RT4膀胱癌细胞后,细胞呈现凋亡,并具有时间和剂量依赖模式。2.IR和咖啡因共同处理后,细胞呈现凋亡,也并具有时间和剂量依赖模式。3.加入浓度为1mM的咖啡因后,受不同放射剂量作用的RT4膀胱癌细胞的凋亡数量均有明显的下降,表明1mM浓度的咖啡因对RT4膀胱癌细胞株有放射保护作用。第二部研究咖啡因(caffeine)对p53野生型RT4膀胱癌细胞周期的影响研究目的：通过对咖啡因(caffeine)、离子射线(IR)和两者联合处理过的p53野生型RT4膀胱癌细胞进行细胞周期检测,以了解咖啡因对p53(+)的RT4膀胱癌细胞周期的影响。材料和方法：流式细胞技术检测各个细胞周期的细胞结果：1.IR照射可引起GO/G1和G2/M细胞期的阻滞,其中以G2/M期阻滞更加明显。2.1mM咖啡因也可引起细胞周期G0/G1和G2/M的阻滞,也对G2/M的阻滞更加明显3.咖啡因降低了IR对膀胱癌RT4细胞周期阻滞的影响,使细胞快速通过GO/G1,却在G2/M期的阻滞增加结论：RT4膀胱癌细胞受照射后发生GO/G1和G2/M细胞周期阻滞的出现和消退与放射敏感性可能有一定的关系,咖啡因通过增加RT4细胞在G2/M期的阻滞,降低了RT4细胞的凋亡,呈现出放射保护作用。第三部分探讨咖啡因(caffeine)影响p53野生型RT4膀胱癌细胞的DNA损伤反应机制研究目的：检测经咖啡因(caffeine)、离子射线(IR)和两者联合处理过的p53野生型RT4膀胱癌细胞的yH2AX, ATM, ATR, pATM, Chkl, Chk2, p-Chk2, p53, p-p53, p21, PUMA, FAS等一系列DNA损伤反应物质,来探讨咖啡因对RT4膀胱癌细胞影响的可能机制。材料和方法：1.免疫荧光法检测yH2AX foci的数量和密度。2.Real time PCR检测p53及其靶基因的表达。3.Western blotting检测p53, p-p53, ATM, p-ATM, ATR, Chk2, p-Chk2, γH2AX, PUMA,p21和Caspase-3等的表达。结果：1.咖啡因通过抑制上游调节物来抑制γH2AX。2.咖啡因抑制了p53以及其靶基因的表达。3.咖啡因降低了IR对RT4膀胱癌细胞的凋亡。结论：1.IR可能通过ATM-Chk2-p53-Puma信号轴对RT4细胞起到杀伤作用。2.咖啡因通过抑制ATM和ATR等DNA损伤-反应网络等上游调节物来抑制γH2AX的表达。3.咖啡因抑制了TP53, p21, PUMA, FAS等p53下游靶基因的表达。4.啡因可能通过抑制RT4膀胱癌细胞的DNA损伤反应信号通路来降低IR对它的杀伤作用,咖啡因对RT4膀胱癌细胞起到了放射保护的作用。第四部分咖啡因(caffeine)对RT4膀胱癌在裸鼠体内影响的研究研究目的：利用体外培养的RT4膀胱癌细胞株接种裸鼠,制造出荷瘤的裸鼠动物模型,然后用离子射线(IR)来照射用咖啡因处理过的实体瘤,来验证咖啡因是否会增加RT4膀胱癌细胞的放射敏感性及其可能的机制。材料和方法：1.RT4膀胱癌细胞的培养。2.RT4膀胱癌细胞的复苏和冻存。3.建立RT4膀胱癌细胞株的裸鼠模型。4.实验分组及处理。5.免疫组化分析检测γH2AX和p-ATM的表达。结果：1.RT4膀胱癌细胞株荷瘤裸鼠动物模型的成功建立。2.咖啡因降低了正常裸鼠膀胱粘膜细胞在IR后的凋亡。3.咖啡因降低RT4膀胱癌细胞对IR的敏感性,减少了IR后γH2AX形成。4.咖啡因降低了IR对RT4膀胱癌细胞的影响,降低了IR后pATM的表达。结论：1.用培养的RT4膀胱癌细胞株能建立良好的荷瘤裸鼠动物模型。2.1mM浓度的咖啡因能降低IR引起的膀胱癌细胞株实体瘤的凋亡。3.1mM浓度咖啡因可能通过抑制了ATM-Chk2-P53-Puma的途径以及激活了其他DNA损伤反应途径而获得了对P53(+)的RT4膀胱癌细胞的保护作用