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【研究背景】肠道菌对人类的健康和疾病有着重要的影响,除了可以分解人体的营养物质、调节免疫系统、产生机体需要的维生素外,某些肠道菌群的失调可能会引发疾病,增加机体患病的概率。研究显示,肠道菌对药物也具有很强的代谢能力。目前,从药物的肠道菌代谢物中寻找潜在生物活性物质已成为新药研发的新领域。传统中药最常用的给药方式为口服给药,口服药物在体内会不可避免的受到肠道菌的影响。许多天然产物经肠道菌群的代谢后,可转化成具有药理活性的物质,尤其是具有水溶性糖苷类天然产物。这类化合物因其分子量和极性较大,在肠内滞留时间较长而易受到肠道菌群的作用,经肠道菌群代谢后生成次生苷或苷元而发挥其药理作用。大量研究表明,天然产物的肠道菌代谢产物才是真正到达靶器官发挥药理作用的活性物质。九节龙皂苷-Ⅰ(Ardipusilloside-Ⅰ,ADS-Ⅰ)是从川产九节龙(Ardisiapusill A.DC)全草中提取出来的一种三萜皂苷,具有溶血性,无法通过静脉给药,而口服给药,在大鼠血浆中无法检测到,其肠道吸收差,生物利用度低,这已成为研发ADS-Ⅰ等皂苷类药物的瓶颈。前期研究表明,ADS-Ⅰ在体内外均有良好的抗癌活性,且口服给药对多种实体瘤均有显著的抑制作用。本课题组研究发现ADS-Ⅰ几乎不能被大鼠胃肠道吸收,吸收进入大鼠体内的物质为其脱糖基的代谢产物。所有这些研究提示ADS-Ⅰ的肠道菌代谢产物可能才是对多种实体瘤发挥抑制作用的真正物质基础。本课题模拟人肠道菌群代谢系统,结合人肠膜Caco-2细胞吸收转运模型,通过液质联用和液核联用等分析技术进行ADS-Ⅰ代谢产物的分离、鉴定与富集,并对分离出的新化合物进行体外抗肿瘤活性检测,并初步考察其细胞转运方式,探索ADS-Ⅰ口服给药在体内抗肿瘤作用的物质基础,从而为寻找新的生物活性物质提供思路和方案。【研究目的】分离、鉴定和富集ADS-Ⅰ经人肠道菌群代谢后的活性产物,并对其体外抗肿瘤活性及细胞转运方式进行初步探讨。【研究方法】1.离体培养人肠道菌对ADS-Ⅰ进行代谢研究,应用高效液相-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)和超高效液相-质谱联用检测器(UHPLC-MS)等分析技术检测并推断ADS-Ⅰ系列代谢产物的结构。2.采用葡聚糖凝胶LH-20柱层析法富集ADS-Ⅰ代谢产物,并通过NMR和MS进行结构鉴定。MTT法初步考察ADS-Ⅰ及其代谢物对人肝癌细胞(SMMC-7721)和人乳腺癌细胞(MCF-7)生长抑制率。3.建立Caco-2细胞模型,采用MTT法测定ADS-Ⅰ及其代谢物对Caco-2细胞的毒性,从而筛选出用于渗透吸收的最佳药物浓度,接着进行药物的双向跨膜转运实验,通过UHPLC-MS法对跨膜转运的药量进行测定,根据公式计算药物的表观渗透系数,从而评价ADS-Ⅰ及其代谢物的肠吸收能力。【研究结果】1.ADS-Ⅰ在人肠道菌群的生物转化下产生4种代谢产物,主要发生脱糖基反应,初步推断其结构分别为3个次生苷(M1、M2、M3)和1个苷元(M4)。2.通过葡聚糖凝胶LH-20柱层析法分离得到ADS-Ⅰ的2种代谢产物(M1和M2),综合核磁共振(NMR)和质谱(MS)数据分析,确定M1为3-O-[α-L-鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)]-α-L-阿拉伯糖-西克拉敏A,M2为3-O-[β-D-吡喃葡萄糖(1→3)]-α-L-阿拉伯糖-西克拉敏A。4.MTT研究结果显示,培养72 h时ADS-Ⅰ及代谢物M1和M2对人肝癌细胞(SMMC-7721)的IC50值分别为5.48±0.47,9.65±0.62,40.91±1.27μmol/L,对人乳腺癌细胞(MCF-7)的IC50值分别为8.77±0.57,24.10±0.83,6.76±0.49μmol/L。结果表明,代谢物M2对人乳腺癌细胞(MCF-7)抑制活性强于原化合物ADS-Ⅰ。5.利用Caco-2细胞模型对ADS-Ⅰ及代谢M1和M2进行吸收转运研究,120min时ADS-Ⅰ从基顶侧(AP)到基底侧(BL)及基底侧(BL)到基顶侧(AP)的表观渗透系数Papp值分别为1.88±0.21×10-6cm·s-1、0.69±0.15×10-6cm·s-1。M1从AP侧到BL侧及BL侧到AP侧双向转运的Papp值分别为4.30±0.43×10-6 cm·s-1、1.76±0.26×10-6cm·s-1,M2从AP侧到BL侧及BL侧到AP侧双向转运的Papp值分别为4.74±0.47×10-6 cm·s-1、2.12±0.23×10-6 cm·s-1,且外排率(ER)均在0.3-0.6之间。结果表明,ADS-Ⅰ通透性较差,口服吸收有限,其代谢物M1和M2具有良好的肠通透性。【研究结论】本研究基于人肠道菌群代谢系统对ADS-Ⅰ进行代谢研究,结果表明ADS-Ⅰ在人肠道中主要以脱糖基方式进行代谢且产生4种代谢产物,我们成功分离得到两个新化合物(M1和M2)。研究发现代谢物M1和M2对人肝癌细胞(SMMC-7721)和人乳腺癌细胞(MCF-7)均有一定的抑制活性,且具有良好的肠通透性,比原型ADS-Ⅰ更有利于吸收,初步推断ADS-Ⅰ及代谢物M1和M2的肠吸收过程主要由被动转运介导。本研究初步阐述了ADS-Ⅰ在人肠道菌群中的代谢及其代谢产物的体外细胞转运方式,这些结果为其在人肠道内转化吸收的进一步研究提供了重要的科学依据,同时为寻找新的具有抗肿瘤活性天然产物提供了新的方法和思路。