巨噬细胞在免疫系统中扮演重要角色,保护机体抵抗病原体感染,调控组织炎症发展。自噬包括细胞将其内部错误折叠的蛋白质、功能异常或结构受损的细胞器及感染细胞的病原微生物等送至溶酶体进行降解等过程,是细胞抵御病原体感染的重要机制之一。本实验室前期研究发现奶牛乳腺炎的主要病原体一金黄色葡萄球菌(S.aureus)可诱导巨噬细胞发生自噬。硒是机体所必需的一种重要微量元素,那么硒对S.aureus感染的巨噬细胞自噬又有何种影响,目前为止尚不明确。课题前期研究表明,硒可有效缓解S.aureus诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激,那么硒是否同样能缓解S.aureus感染的巨噬细胞氧化应激,有待于进一步研究。鉴于此,本试验以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为研究对象,研究硒对S.aureus感染的巨噬细胞自噬及其相关信号通路(NF-κB和MAPK)的影响,同时探讨硒对S.aureus感染的巨噬细胞氧化应激及其相关信号通路(PI3K/Akt/mTOR)的影响。为研究硒对S.aureus感染的巨噬细胞自噬及其相关信号通路(NF-κB和MAPK)的影响,试验分为空白对照组、S.aurus感染组、补硒组和硒与.aurs共处理组。采用2μM的硒预孵育细胞12 h后,按MOI=1:1的比例接种S.aureus,45 min后终止处理进行相关研究。采用Western Blot检测细胞自噬相关蛋白Beclinl、p62、LC3和Atg5以及MAPK与NF-κB信号通路关键蛋白的表达水平;采用激光共聚焦法观察细胞内LC3蛋白聚点荧光强度;采用透射电镜观察细胞超微结构的变化,同时采用平板计数法研究S.aureus在巨噬细胞内的细菌载量变化。结果显示:与空白对照组相比,S.aureus感染巨噬细胞后,极显著提高自噬相关蛋白Atg5、Beclin1、LC3ⅡI和p62的表达量(p<0.01),激光共聚焦显微镜可见细胞内明显的LC3蛋白荧光聚点,透射电镜可见包裹S.aureus的囊泡及自噬体,极显著提高NF-κB和MAPK信号通路的关键蛋白磷酸化水平(p<0.01);与S.aureus感染组相比,补硒后极显著升高LC3Ⅱ表达量(p<0.01),极显著降低p62表达量(p<0.01),激光共聚焦显微镜观察细胞内LC3蛋白荧光聚点增多,透射电镜可见包裹S.aureus的囊泡和自噬体,极显著降低NF-κB和MAPK信号通路的关键蛋白磷酸化水平(p<0.01);同时,与S aureus感染组相比,补硒后,在1 h、2 h和3 h时细胞内细菌载量显著或极显著降低(p<0.05或p<0.01)。结果表明,硒能促进S.aureus感染的RAW264.7 巨噬细胞自噬,且能缓解自噬流阻滞,有利于巨噬细胞对S.aureus的清除,抑制胞内菌的增殖,并能显著抑制NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白表达水平。为研究S.aureus感染巨噬细胞后,硒对巨噬细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路及其氧化损伤的影响,细胞处理同上进行后续实验。Western Blot检测细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平,流式细胞仪检测细胞ROS水平和线粒体膜电位的变化,比色法检测细胞T-SOD、CAT和GSH-Px的活性及MDA与T-AOC的水平。结果显示:与空白对照组相比,S.aureus感染后极显著提高细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平(p<0.01);细胞内的ROS水平极显著升高(p<0.01),细胞的线粒体膜电位极显著降低(p<0.01);CAT、T-SOD、GSH-Px的活性均极显著下降(p<0.01),MDA含量升高,T-AOC降低,差异均极显著(p<0.01);与S.aureus感染组相比,补硒后极显著降低细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平(p<0.01),细胞内的ROS水平极显著降低(p<0.01),细胞的线粒体膜电位显著上升(p<0.05),CAT、T-SOD和GSH-Px的活性均极显著上升(p<0.01),MDA含量降低,T-AOC升高,差异均极显著(p<0.01)。结果表明,硒能显著提高S.aureus感染的RAW264.7细胞的抗氧化酶活性,降低ROS水平和MDA的生成,同时提高线粒体膜电位水平,并可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的蛋白表达,提高细胞的抗氧化能力。综上所述,硒可通过促进RAW264.7自噬,缓解自噬流的阻滞,抑制MAPK和NF-κB信号通路关键蛋白,降低炎症反应,同时抑制PI3K/Akt/mTOR,提高细胞的抗氧化能力,稳定线粒体膜电位,减少ROS产生,缓解S.aurus导致的细胞损伤。该研究为临床奶牛乳腺炎的防治提供了新的思路和方法。