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甘蔗(Saccharum officinarum)是最主要的糖料作物,而甘蔗黑穗病(Sporisorium scitamineu)是我国蔗区最严重的一种气传真菌病害,严重影响甘蔗产量和糖分产量。目前普遍认为,以甘蔗抗黑穗病品种取代感病品种是防治黑穗病最经济有效的措施。但是,由于甘蔗遗传背景复杂,甘蔗优良基因型重组概率低至1/300,000,单纯依靠传统杂交和系圃选择的途径来培育高产、优质、抗病兼具的优良品种难度大。通过挖掘甘蔗抗病基因,一方面可以为转基因改良提供优异基因资源,另一方面还可以为进一步开发抗病标记辅助选择技术奠定基础。植物几丁质酶(Chitinase)是一种典型的病程相关蛋白,已经成为作物抗真菌病害的研究热点之一。它能够降解真菌细胞壁的重要成分—几丁质,抑制真菌生长,从而提高植物对病原真菌的防御能力。鉴于此,进行甘蔗几丁质酶家族基因的分离与鉴定对甘蔗抗真菌性病害的聚合育种具有重要意义。本研究通过同源克隆法,从甘蔗中分离获得4个几丁质酶家族基因的全长cDNA序列。而后,应用生物信息学软件,对基因所编码的蛋白结构和功能进行预测分析。同时,采用实时荧光定量PCR技术,研究了甘蔗几丁质酶基因在甘蔗上的组织表达特性及其响应甘蔗黑穗病病原菌、信号因子和环境胁迫的表达模式。并进一步利用农杆菌介导转化法,将几丁质酶基因导入模式植物烟草(Nicotiana tabacum)中,研究基因过表达的效应。研究结果为揭示甘蔗几丁质酶家族基因的功能鉴定及及在甘蔗抗逆育种上的应用奠定基础。主要研究结果与结论如下：1.甘蔗几丁质酶家族基因cDNA全长序列克隆与分析采用同源克隆法,根据高粱基因组数据库中的假定几丁质酶基因序列,设计特异性引物,利用RT-PCR技术,克隆获得4个甘蔗几丁质酶家族基因cDNA序列,其中3个以甘蔗基因型崖城05-179接种黑穗病菌后48h样品为模板获得的,命名为：ScChiⅣ1、ScChiⅦ1和ScChiⅦ2,序列长度依次为：906bp、907bp和1,005bp, ORF分别为813bp,900bp和990bp。 GenBank登录号分别为：KF664178、KF279662和KF664179；以崖城05-179组培苗4℃处理24h后的样品为模板,克隆获得1个几丁质酶家族基因,命名为ScChi I1,长度1,085bp, ORF为978bp, GenBank登录号为KF664182。序列分析表明,上述4个基因序列的一致性介于22.7%-62.5%之间,其编码蛋白与其他植物来源的几丁质酶氨基酸序列同源性较高,分别属于几丁质酶家族Class Ⅰ、 Class Ⅳ和Class Ⅶ (ScChiⅦ1和ScChiⅦ2)。3个类型的几丁质酶基因在核苷酸、氨基酸序列和结构域上存在显著差异。2.甘蔗几丁质酶基因的表达模式分析荧光定量检测结果表明,4个甘蔗几丁质酶基因在蔗芽、叶、蔗髓和蔗皮中均有表达,属组成型表达,但ScChi I1在叶和蔗皮中表达量最高,ScChiⅣ1在叶中表达量最高,ScChiⅦ1和ScChiⅦ2在蔗芽中表达量最高。所克隆的4个ScChi对甘蔗黑穗病菌胁迫响应的表达模式存在甘蔗基因型差异,其中ScChi I1和ScChiⅦ1在抗病和感病基因型中表现一致。表现在：在抗病基因型崖城05-179中,ScChi I1的转录水平显著提高,但ScChiⅣ1, ScChiⅦ1和ScChiⅦ2的转录水平却呈现出明显下降的趋势,说明ScChi I1正响应黑穗病菌胁迫,但其余3个基因则为负响应；在基因型"ROC"22中,接种后24h, ScChi I1、ScChiⅣ1和ScChiⅦ2的转录水平均呈现显著上升趋势,但ScChiⅦ1转录水平则明显下降,说明ScChi I1在感病基因型中也正响应黑穗病菌胁迫,而ScChiⅦ1依然为负响应。甘蔗几丁质酶基因对信号物质(水杨酸、茉莉酸甲酯、脱落酸)和环境(干旱、NaCl、重金属和低温)胁迫的应答反应不同。受水杨酸(Salicylic acid, SA)、茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate, MeJA)、脱落酸(Abacisic acid, ABA)胁迫后,ScChi I1转录本水平均呈现显著上升趋势；ScChiⅣ1基因表达受MeJA和ABA显著诱导,但受SA的显著抑制；受ABA胁迫后,ScChiⅦ1转录本水平呈现上升的趋势,受MeJA和SA胁迫后,ScChiⅦ1表达水平呈现下降的水平；受SA、MeJA、ABA胁迫后,ScChiⅦ2转录水平均显著下降,并呈现全程抑制趋势。受干旱(PEG)、NaCl和重金属(CuCl2)胁迫后,ScChi I1转录本水平呈现显著上升,但低温(4℃)却抑制ScChi I1的转录；上述环境胁迫显著提高了ScChiⅣ1基因的转录,且呈现持续上升趋势；除低温(4℃)外,ScChiⅦ1的转录水平均呈现下降趋势；除NaCl胁迫外,在胁迫后24h,ScChiⅦ2的表达量明显提高。上述结果说明,甘蔗几丁质酶家族基因具有多样性的功能。3.亚细胞定位分析利用农杆菌介导法,将带有不同目的基因ScChi (ScChi I1、 ScChiⅣ1或ScChiⅦ2)的植物亚细胞定位载体质粒pCAMBIA-2300-ScChi-GFP渗透导入烟草叶片,显微镜下观察到pCAMBIA-2300-ScChiⅦ2-GFP重组蛋白的荧光信号定位于细胞核和细胞质。4. ScChi I1基因的原核表达分析成功构建了带有ScChi I1基因的原核表达载体pET32a-ScChi I1,经IPTG诱导,在大肠杆菌(E. coli)表达菌株BL21细胞中,得到目的融合蛋白,分子量为52.5kDa,为该基因编码蛋白的体外抑菌活性验证奠定基础。5. ScChiⅦ2基因瞬时表达分析构建了植物超表达载体pCAMBIA-1301-ScChiⅦ2,其在烟草叶片中的瞬时表达结果显示,二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)染色颜色加深和电导率增加,表明H2O2的积累,说明ScChiⅦ2引起植物过敏反应。6.甘蔗几丁质酶基因遗传转化烟草研究构建植物超表达载体pCAMBIA-1301-ScChi Ⅰ1/ScChiⅣ1/ScChiⅦ2,通过农杆菌介导法转化烟草的叶盘,获得18株PCR检测呈阳性的转ScChiⅣ1基因To代烟草植株,研究结果为进一步探究ScChi在烟草中过表达对烟草抗病性的影响奠定基础。上述研究结果初步确定了4个甘蔗几丁质酶家族基因的功能及表达模式,为后续开发该基因作为甘蔗抗逆育种的生物标记和遗传改良奠定物质基础并提供科学依据。