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猫衣原体（Chlamydia felis,C.felis）是猫衣原体病的病原体。与猫疱疹病毒-I型（Feline Herpeto Virus-1,FHV-1）、猫杯状病毒（Feline Calici Virus,FCV）同是引起猫上呼吸道疾病（FURTD）的主要病原。轻者引起猫结膜炎、鼻炎及咽炎,严重者表现为肺炎、关节炎和跛行等。临床病例中,感染猫衣原体的人和动物通过抗菌治疗治愈（如两性霉素）,但易复发。由于猫衣原体感染的群体广泛性以及反复性,预防人和动物感染猫衣原体疾病、控制猫衣原体传播的最佳途径是研究安全有效的疫苗。目前猫衣原体疫苗研究主要集中在新型疫苗、减毒活疫苗或全灭活生物疫苗等方面。研究过程中发现,使用全菌为基础的灭菌疫苗或者减毒活疫苗并不是很好的选择,因为全菌疫苗保存的一些特定抗原成分能够导致一定的病理反应,减毒活疫苗则存在反强的可能,对公共卫生存在潜在的威胁。新型疫苗安全、有效,不含有衣原体全菌疫苗中副作用的部分,不存在返祖造成机体持续性感染的危险,而且还可以诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,保护机体免受衣原体的感染。然而研制安全有效的新型疫苗目前面临的两大难题是保护性抗原和抗原呈递载体的选择。主要外膜蛋白（major outer membrane proteins,momp）同时含有T细胞和B细胞表位,可诱导特异性抗猫衣原体免疫反应。在不同的衣原体血清型中序列高度保守。因此,本次实验选择猫衣原体主要外膜蛋白作为保护性抗原。据文献报道重组狂犬病病毒二联疫苗作为免疫原具有安全、高效、可刺激机体产生高水平中和抗体、有效诱导T细胞免疫应答的特点。利用反向遗传技术拯救的重组狂犬病病毒因病毒产量高、外源蛋白表达水平高、易于大量制备的优势曾多次作为载体应用于不同蛋白的表达。杆状病毒表达载体近年来备受青睐,以AcMNPV为基础的杆状病毒表达载体系统发展迅速,应用十分普遍。杆状病毒表达载体具有诸多优势:利用杆状病毒表达载体表达的重组蛋白与天然蛋白具有相似的生物活性;外源基因容量大,适合较大的基因克隆和同时多个基因的克隆;生物安全性好,杆状病毒不感染包括人在内的哺乳动物;在双启动子调控下,重组蛋白具有很高的表达水平。狂犬病病毒表达载体、杆状病毒表达载体凭借自身优势成为抗原呈递载体候选。本研究采用狂犬病病毒SRV9株反向遗传载体、杆状病毒表达载体构建表达momp的重组病毒,通过血清学实验,进行免疫原性评价。重组狂犬病病毒（SRV9-MOMP）的拯救:基于RABV SRV9株反向遗传操作系统,在其P与M基因间隔区插入猫衣原体的主要外膜蛋白基因（MOMP）,构建含有MOMP结构的重组质粒pUC57-SRV9-MOMP（P/M）。经PCR鉴定、基因测序,正确的重组狂犬病病毒感染性全基因组质粒pUC57-SRV9-MOMP（P/M）与其辅助质粒共同转染至BSR-T7细胞拯救重组狂犬病病毒SRV9-MOMP。从基因组和蛋白两个方面鉴定外源基因的插入及表达情况,研究重组毒的生长动力学、遗传稳定性和致病性等特性。免疫荧光观察结果表明重组狂犬病病毒拯救成功;RT-PCR结果显示,MOMP基因已成功插入重组病毒基因组中,并在传代过程中遗传稳定;Western Blot分析证明猫衣原体momp在SRV9-MOMP中成功表达;生长动力学曲线表明重组病毒与母本病毒在BSR-T7细胞上的增值水平无显著差异,SRV9-MOMP病毒滴度可达到1×108.125TCID50/mL;乳鼠颅内攻毒实验表明,与母本病毒相比,重组病毒的致病性降低。此部分实验构建了插入猫衣原体MOMP基因的重组狂犬病病毒感染性全基因组质粒pUC57-SRV9-MOMP（P/M）,拯救了SRV9-MOMP重组病毒,病毒滴度高、外源蛋白momp遗传稳定、该重组病毒可作为疫苗候选用于进一步的免疫研究。重组杆状病毒（Ac-MOMP）构建:基于杆状病毒表达载体,将猫衣原体MOMP基因克隆至pFastBacI载体的多克隆位点,获得重组质粒pFastBacI-MOMP（pF-MOMP）。经PCR鉴定正确的重组质粒转化到DH10Bac大肠杆菌感受态中,经蓝白斑筛选后,将鉴定正确的重组杆粒Bacmid-MOMP（Bac-MOMP）转染Sf9细胞,拯救表达momp的重组杆状病毒AcMNPV-MOMP（Ac-MOMP）。细胞形态观察、荧光观察表明重组杆状病毒拯救成功;Western Blot分析,momp可在重组杆状病毒Ac-MOMP中稳定遗传。该重组病毒安全性好、易于大量制备,可作为疫苗候选用于进一步的免疫研究。为了探究重组病毒SRV9-MOMP和Ac-MOMP灭活后的免疫保护效力:将重组病毒SRV9-MOMP和Ac-MOMP灭活后按照最高剂量相同体积分别对猫进行免疫,通过肌肉注射免疫2次,相隔14 d。首免后2周、4周、6周、8周采集血清。最后,采用猫衣原体进行攻毒试验。采用中和试验检测重组病毒SRV9-MOMP和Ac-MOMP灭活后免疫猫刺激机体产生的抗momp中和抗体水平,评价灭活病毒的免疫保护效力;采用FAVN检测灭活病毒SRV9-MOMP免疫的猫体内抗RABV中和抗体水平。中和试验结果显示经灭活病毒SRV9-MOMP和Ac-MOMP免疫猫的血清中含有高效抗momp中和抗体,能够保护机体免受猫衣原体的感染。FAVN试验表明,灭活病毒SRV9-MOMP免疫的猫血清含有高滴度的抗RABV中和抗体。本实验结果表明,灭活病毒SRV9-MOMP与Ac-MOMP均可诱导猫产生针对于猫衣原体momp中和抗体;加强免疫后,抗体水平显著增高。与灭活重组杆状病毒相比,SRV9-MOMP诱导猫产生抗momp中和抗体滴度更高,并产生高滴度的抗RABV中和抗体,基于灭活SRV9-MOMP重组病毒具有良好的免疫原性,滴度高、高效表达外源蛋白、可大量制备等优点,为研制新型“低成本-高效”猫衣原体疫苗提供新思路。