丹参酮ⅡA调节人羊膜上皮WISH细胞水通透性及其机制的研究

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本文主要从以下几方面进行了论述:  第一部分 丹参酮ⅡA对人羊膜上皮WISH细胞水通透性的影响  目的:探讨丹参酮ⅡA对人羊膜上皮WISH细胞水通透性的影响。  方法:CCK-8方法检测丹参酮ⅡA对人羊膜上皮WISH细胞增殖活力的影响,倒置显微镜下观察丹参酮ⅡA作用前后细胞大小的变化,电镜观察细胞中各细胞器的变化。  结果:检测不同浓度(0μ mol/L,5μ mol/L,10μ mol/L,50μ mol/L,100μ mol/L,150μ mol/L,200μ mol/L)丹参酮ⅡA对人羊膜上皮WISH细胞增殖活力的影响,得到IC50浓度为35μ mol/L;应用IPP软件分析细胞人小发现,与空白对照组相比,35μ mol/L丹参酮ⅡA处理人羊膜上皮WISH细胞24h,细胞明显变大,差异有统计学意义(P<0.05);电镜下观察到:与空白对照组相比,35μ mol/L丹参酮ⅡA孵育人羊膜上皮WISH细胞24h,细胞肿胀,细胞膜微绒毛水肿增粗,包膜界限欠清晰;细胞胞质由致密变疏松,出现部分溶解现象,同时核糖体增加;细胞核膜水肿,间隙增大,线粒体肿胀,出现空泡,由致密变疏松;内质网扩张变圆变大,空泡增多,粗面内质网变光滑,部分脱颗粒现象。  结论:丹参酮ⅡA增加了人羊膜上皮WISH细胞对水的通透性。  第二部分 丹参酮ⅡA调节人羊膜上皮WISH细胞中水通道蛋白表达的研究  目的:探讨AQP1、AQP3、AQP8、AQP9在人羊膜上皮WISH细胞的表达,探讨丹参酮]ⅡA对人羊膜上皮WISH细胞中AQP1、AQP3、AQP8、AQP9表达的影响。  方法:免疫细胞化学染色方法检测人羊膜上皮WISH细胞中AQPs的定位,免疫印迹方法检测细胞中AQP1、AQP3、AQP8、AQP9蛋白的表达。检测不同浓度(0μ mol/L,5μ mol/L,20μ mol/L,35μ mol/L,50μ mol/L,65μ mol/L)丹参酮ⅡA作用不同时间(0h,6h,12h,24h,48h)人羊膜上皮WISH细胞中AQP1、AQP3、AQP8、AQP9蛋白表达的变化。  结果:免疫细胞化学染色结果显示AQP1、AQP3、AQP8、AQP9主要表达在人羊膜上皮WISH细胞的胞浆中。丹参酮Ⅱ A上调了人羊膜上皮WISH细胞中AQP1、AQP3、AQP8、AQP9蛋白的表达,上调AQP1、AQP3蛋白表达最显著的丹参酮ⅡA浓度是35μ mol/L,上调AQP8、AQP9蛋白表达最显著的丹参酮ⅡA浓度是5μ mol/L,35μ mol/L的丹参酮ⅡA上调AQP1、AQP3蛋白表达最显著时间为24h,5μ mol/L的丹参酮ⅡA上调AQP8、AQP9表达最显著的时间为24h。  结论:丹参酮ⅡA上调了人羊膜上皮WISH细胞中 AQP1、AQP3、AQP8、AQP9蛋白的表达,不同浓度的丹参酮ⅡA上调的水通道蛋白不同,在不同时间点上调的水通道蛋白也不同,四种水通道蛋白之间可能存在相互代偿。  第三部分 丹参酮ⅡA调节人羊膜上皮WISH细胞中AQPs表达的MAPK相关信号通路研究  目的:探讨丹参酮ⅡA调节人羊膜上皮WISH细胞中AQPs表达的MAPK相关信号通路。  方法:35μ mol/L和5μ mol/L丹参酮ⅡA作用人羊膜上皮WISH细胞24h,通过MAPK信号转导通路抗体芯片,筛查相关的MAPK信号转导通路蛋白。应用siRNA干扰技术和抑制剂下调得到的相关信号转导通路蛋白,将细胞分成四组:空白对照组;siRNA组(抑制剂组);丹参酮ⅡA组;siRNA(抑制剂)+丹参酮ⅡA组,应用免疫印迹方法检测AQP1、AQP3、AQP8、AQP9及MAPK信号转导通路蛋白的表达,观察该通路对丹参酮ⅡA调节人羊膜上皮WISH细胞中AQP1、AQP3、AQP8、AQP9蛋白表达的影响。  结果:通过MAPK信号转导通路抗体芯片检测,筛查出丹参酮ⅡA作用细胞相关的信号转导通路蛋白为糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)。应用GSK3β-siRNA、GSK-3β的抑制剂LiCl进一步证实丹参酮ⅡA调节人羊膜上皮WISH细胞中水通道蛋白表达的信号通路与GSK-3β相关。  结论:丹参酮ⅡA通过GSK-3β信号通路调节人羊膜上皮WISH细胞中水通道蛋白表达,从而增加了人羊膜上皮WISH细胞对水的通透性。
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