钾离子(K~+)是植物细胞内含量最丰富的一价阳离子,在植物的生长和发育过程中具有重要作用。足够的K~+供应能够增强作物对各种生物和非生物胁迫(如干旱、高盐等)的耐受性,而K~+不足植物会表现出叶色发黄、生长受抑制等缺钾症状。前人研究表明植物对K~+的吸收、转运与分配主要通过钾离子转运通道蛋白和钾离子转运体完成,而钾离子转运体被认为是高亲和性钾吸收系统中的主要成员,负责逆电化学梯度对K~+进行主动运输,并使其在体内高度富集。其中HAK/KUP/KT家族是钾离子转运体最庞大的一个家族,在水稻、拟南芥和白杨中已经分别鉴定出27、13和31个HAK家族基因。目前,在小麦中HAK家族基因只有TaHAK1和TaHAK11被克隆,但是对该家族基因功能的研究还很少。本研究利用同源克隆的方法得到小麦HAK家族基因TaHAK1-B、TaHAK5、TaHAK10、TaHAK14-A和TaHAK14-B,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因的表达情况;利用烟草瞬时表达系统对TaHAK1-B基因进行了亚细胞定位分析;借助缺陷型酵母系统异源表达TaHAK1-B,初步鉴定该基因具有转运钾离子和钠离子的功能;并通过在野生型拟南芥中过表达TaHAK1-B,进一步验证该基因在植物中的功能。主要研究结果如下:(1)从普通六倍体小麦品种矮抗58的gDNA中扩增得到TaHAK1-B基因,基因长度3092 bp,cDNA中扩增到TaHAK1-B基因ORF 2307 bp,编码768个氨基酸;TaHAK5基因ORF 2358 bp,编码785个氨基酸;TaHAK10基因ORF 2484 bp,编码827个氨基酸;TaHAK14-A和TaHAK14-B基因ORF均为2562 bp,编码853个氨基酸。进化分析发现TaHAK1-B、TaHAK5属于HAK家族进化簇Ⅰ,TaHAK10属于HAK家族进化簇Ⅱ,TaHAK14-A和TaHAK14-B属于HAK家族进化簇Ⅴ。(2)利用qRT-PCR方法对这些基因在小麦不同组织中的表达情况进行了分析,发现这四个基因在根、茎、幼叶、老叶及籽粒中均有表达。TaHAK1-B在小麦根部表达量最高,其次是茎;TaHAK5在小麦幼叶中表达量最高,其次是茎、老叶;TaHAK10组织表达模式类似于TaHAK5;TaHAK14基因在小麦茎中表达量最高,其次是叶片。(3)在耐低钾品种豫农186(YN186)中,通过qRT-PCR分析四个基因在缺钾条件下根和叶中的表达模式。TaHAK1-B基因的表达在根中明显受钾离子胁迫诱导上调表达;TaHAK5基因经缺钾胁迫在叶片中表达明显上调,缺钾处理12 h表达量最高,约为0 h的11倍,但其在根中则变化不明显;TaHAK10和TaHAK14均受钾离子胁迫在叶片中被诱导上调表达,而其在根中的表达几乎不受影响。(4)利用烟草瞬时表达系统进行亚细胞定位分析,发现TaHAK1-B定位于细胞膜上,表明TaHAK1-B蛋白可能在细胞膜上发挥功能。(5)在钾敏感突变体酵母菌株CY162中表达TaHAK1-B基因,发现转基因酵母在低钾培养基上比转空载体酵母长势好,表明TaHAK1-B具有转运钾离子的功能。另外,将TaHAK1-B转入盐敏感突变体酵母菌株AXT3K中,在含钠离子培养基上,转基因酵母的长势好于转空载体酵母菌株的长势,表明TaHAK1-B具有转运钠离子的功能。(6)构建TaHAK1-B的超表达载体遗传转化拟南芥,对转基因植株进行表型分析。在含有3 mmol·L~-11 K~+的培养基上转基因株系的根长明显比野生型长,且侧根较野生型多;在100μmol·L~-11 K~+的低钾培养基上野生型几乎不能正常生长,而转基因拟南芥还能生长。这些结果表明TaHAK1-B可能在根的伸长和侧根的发生中具有重要作用。