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乳腺癌是危害女性健康最常见的恶性肿瘤之一,在西欧、北美等发达国家,乳腺癌发病率居女性癌瘤的首位,我国虽属低发国家,但其发病率亦有明显上升趋势,10年升高约30%,在北京、上海、天津等大城市的乳腺癌发病率已跃居女性各种癌瘤的首位。 近年来,有关mtDNA突变与包括乳腺癌在内的各种实体性肿瘤的相关性报道逐渐增多。为了进一步探讨mtDNA突变在乳腺肿瘤的病因学和病理学上所可能提供的理论指导,阐明线粒体基因组的表达调控、核基因组同线粒体基因组相互作用的分子遗传学机制,极有必要建立一种特殊的细胞模型,即无线粒体DNA(mtDNA-less)细胞模型或称为rho-zero(ρ~0)细胞。它的出现允许我们将患者细胞的线粒体从一个细胞环境移向另一个,或者引入新的基因进入线粒体,为明确线粒体基因组损伤在恶性肿瘤甚至其他一些常见线粒体疾病中的潜在作用提供了很好的研究平台。 本实验利用低剂量EtBr(50ng/ml)抑制mtDNA复制的方法,尝试筛选并建立一株不含mtDNA的乳腺癌T47D ρ~0细胞系,并探讨它在生长特征、细胞周期、早期凋亡和超微结构等方面与对照T47D细胞的差别。研究主要分为如下两大部分: 第一部分:采用经典的低剂量EtBr抑制mtDNA复制的方法,在补充外源性的尿嘧啶和丙酮酸钠的条件下,经约32天的特殊培养后,分离并筛选无mtDNA的人乳腺癌T47D ρ~0细胞。并经过Dot Blot、real-time PCR和选择性培养基等方法反复鉴定后,确认该细胞株内mtDNA缺失并具有ρ~0细胞共有的营养依赖型体外生长特性。该细胞能在含尿嘧啶、丙酮酸钠和15%的Gibco胎牛血清环境中连续传代、稳定生长。 第二部分:采用显微镜形态学、MTT法绘制生长曲线、体外克隆形成实验和PI细胞周期等实验对T47D ρ~0细胞的生长动力学特征进行分析,发现T47D ρ~0细胞较对照组T47D细胞的形态略小、皱缩,分裂相少,生长繁殖能力更缓慢,G0-G1期细胞比例上升、S期细胞的比例下降,出现G1-S期阻滞现象。利用流式细胞术检测(AnnexinⅤ和rhodamine123)分析mtDNA缺失和细胞凋亡的关系,结果显示检测虽然T47D ρ~0细胞的线粒体跨膜电位较正常有明显的下降,但mtDNA缺失