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背景缺血性心律失常是心脏疾病中最常见的并发症之一,在世界范围内造成了严重的健康损失。目前临床上使用的抗心律失常药物以离子通道阻滞剂为主,在降低死亡风险及改善预后方面尚不能完全满足临床需求。这促使临床防治心律失常的理念不断创新发展,越来越多的学者致力于改善心律失常发生的基质。在新的治疗策略中,中医药特色受到广泛关注,其中,稳心颗粒在长期临床实践中展现出良好的疗效和安全性。稳心颗粒抗心律失常的作用机制尚未达成广泛共识,尽管基础研究众多,但研究方法和评价标准各异,需进行系统的分析梳理,寻找有价值的线索和证据。值得关注的是,稳心颗粒的作用似乎与内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)和缝隙连接(Gap Junction,GJ)有关。干预心肌缝隙连接重构是改善心律失常发生基质的重要研究方向,心肌中主要表达缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43),内质网应激信号通路参与了 Cx43表达的调控。因此,本研究首先总结稳心颗粒抗心律失常机制的效应特点和证据质量,系统评价稳心颗粒对心肌缺血后心脏电生理重构的影响,参考其中与Cx43有关的证据,以指导后续开展细胞实验,进而从离体细胞水平验证稳心颗粒能否通过调控内质网应激途径干预Cx43的表达,旨在为深入认识稳心颗粒防治心律失常的作用机制提供新的循证和实验研究证据。目的1.通过循证研究全面分析稳心颗粒基础研究的效应特点和证据质量,系统评价稳心颗粒对大鼠心肌缺血后心脏电生理重构的影响,为深入认识稳心颗粒防治心律失常的作用机制提供循证依据。2.在循证证据指导下设计实验研究,从离体细胞水平研究稳心颗粒通过内质网应激途径干预H9C2细胞Cx43表达的作用机制。方法1.稳心颗粒基础研究的系统评价1.1以“稳心”的中英文检索式为主题词检索中国知网(CNKI)、维普数据库(VIP)、万方数据库(Wanfang Data)和中国生物医学文献数据库(CBM)、EBbase、Pubmed、The Cochrane Library、Web of Science数据库中的期刊学术论文,根据纳入排除标准筛选文献,提取纳入研究的特征信息,分析稳心颗粒基础研究的效应特点及证据质量。1.2系统评价稳心颗粒对心肌缺血后心肌电生理重构的影响,运用SYRCLE动物实验偏倚风险评估工具(SYRCLE’s risk of bias tool for animal studies)对文献质量进行评估并分析结局指标。2.构建H9C2细胞内质网应激模型并观察Cx43表达的变化2.1体外培养H9C2细胞,模拟生长曲线,建立稳定的研究载体。2.2 cck-8法摸索出TG的有效刺激浓度范围和最佳造模条件(浓度-时间)。2.3 Western Blot(WB)、流式细胞术检测内质网应激标志分子及细胞凋亡率,验证H9C2细胞内质网应激模型是否成功构建。2.4光镜下观察造模后H9C2细胞形态的变化,并使用免疫荧光染色初步观察Cx43的表达变化。3.稳心颗粒对内质网应激状态下H9C2细胞Cx43表达的影响3.1 cck-8法筛选出稳心颗粒浸出液的无毒性浓度范围和最佳效应浓度。3.2cck-8法摸索内质网应激相关蛋白降解路径特异性阻断剂MG-132、Chloroquine、Salubrinal的无毒性浓度范围以及对TG毒性的影响。3.3根据3.2的结果选择阻断剂以及其阻断的途径,实验中随机分为空白对照组、内质网应激模型组、内质网应激相关蛋白降解路径阻断组、稳心颗粒干预组,采用流式细胞术、WB法、免疫荧光法检测各组标志性分子及Cx43表达的变化,分析稳心颗粒的作用机制。结果1.稳心颗粒基础研究的系统评价1.1稳心颗粒效应特点及证据质量:共纳入49篇稳心颗粒基础研究,其中18篇主要采用膜片钳技术直接检测心肌电生理,另31篇则是与心肌缺血、心衰、心脏毒性有关的研究,采用随机对照体内外实验方式验证稳心颗粒的干预作用,总体上稳心颗粒主要干预缺血性心肌损伤,然而其给药途径、给药浓度及作用周期各异,各研究的结局指标也差异较大。1.2稳心颗粒对心肌缺血后心肌电生理重构影响的评价结果:共纳入7篇有效动物实验研究,评估后认为质量均较低。主要结局指标是心电图、缝隙连接结构、缝隙连接蛋白、相关MicroRNAs(miRNAs)以及心肌细胞动作电位参数等,由于纳入研究中结局指标均缺少具体数值,无法量化,故使用描述性系统评价对结局指标进行总结性评价,总体上各个指标都能一定程度上反应出稳心颗粒的干预作用,其中,稳心颗粒对缝隙连接干预机制值得进一步深入研究。2.构建H9C2细胞内质网应激模型并观察Cx43表达的变化2.1 TG对H9C2细胞活性的影响呈时间-浓度依赖性,有效刺激浓度范围为大于0.1μmol/L,TG溶液在0.1、0.5μmol/L浓度时处理H9C2细胞24小时,细胞生长活力达到半数抑制率。2.2选择TG溶液0.1μmol/L浓度刺激H9C2细胞24小时为造模条件,WB显示,与空白对照组相比,模型组内质网应激标记分子GRP78、CHOP表达显著增加,流式细胞术则提示模型组细胞大量出现早期凋亡,证明细胞模型成功构建。2.3光镜下观察模型组细胞呈现明显形态学改变,免疫荧光染色观察模型组Cx43表达减少。3.稳心颗粒对内质网应激状态下H9C2细胞Cx43表达的影响3.1 cck-8比色分析结果显示,稳心颗粒浸出液无毒性浓度范围为小于20g/L,最佳效应浓度为10g/L。3.2 cck-8比色分析结果显示,小于或等于30μmol/L为MG-132的无毒性浓度范围,小于或等于40μmol/L为Chloroquine和Salubrinal的无毒性浓度范围。在以上浓度范围下,MG-132未能降低TG的细胞毒性,Chloroquine对TG毒性的影响无统计学差异,而Salubrinal对TG毒性有显著的抑制作用,因此本研究的后续实验选择内质网应激凋亡途径阻断剂Salubrinal作为阳性对照。3.3根据3.2结果确定实验方案,随机分为空白对照组、内质网应激模型组、Salubrinal凋亡抑制组、稳心颗粒干预组。光镜下观察模型组细胞形态学发生明显改变,与之相比,Salubrinal和稳心颗粒都明显地改善了细胞形态。3.4流式结果显示,与对照组比较,其余三组的细胞凋亡率显著增加,与内质网应激模型组比较,Salubrinal凋亡抑制组及稳心颗粒干预组的细胞凋亡率都明显下降。3.5 WB结果显示,与对照组比较,内质网应激模型组内质网应激感受蛋白GRP78、凋亡信号分子CHOP及胱天蛋白酶水解途径标志分子Caspase12表达显著增高,而Cx43蛋白的表达量显著减少,与内质网应激模型组比较,Salubrinal凋亡抑制组和稳心颗粒干预组的CHOP、Caspase12表达明显下降,Cx43则明显增加,Salubrinal凋亡抑制组GRP78表达无显著差异,而稳心颗粒干预组的GRP78则显著上调。3.6免疫荧光染色结果提示,内质网应激模型组凋亡细胞周围Cx43的表达明显减少,且有向核膜聚集的趋势,而Salubrinal凋亡抑制组和稳心颗粒干预组的细胞Cx43表达明显增加,且在胞浆中分布更均匀,更靠近细胞膜边缘。结论1.稳心颗粒在心肌缺血、心衰、心脏毒性等疾病模型中发挥保护作用,具体效应体现在心肌病理、心肌电生理、血流动力学等心功能指标的改善,以及心室重构相关基因、蛋白的调节。虽然目前稳心颗粒基础研究的差异较大,研究质量偏低,方法学设计也有待完善,但是稳心颗粒能够通过干预缝隙连接改善大鼠缺血心肌电生理重构的作用值得关注和进一步深入研究。2.在离体细胞水平上,TG诱导的内质网应激凋亡途径会影响Cx43的表达,稳心颗粒可以通过抑制内质网应激凋亡途径改善H9C2细胞Cx43的表达。