性别决定基因是决定性别的开关,它控制着双向潜能性腺分化为卵巢或是精巢。Amh(Anti-Miillerian hormone)及其受体AmhrⅡ(Anti-Mullerian hormone receptor type II)属于TGF-β超家族成员,对四足动物的研究表明它们的功能是诱导雄性的缪勒氏管退化,但鱼类并没有缪勒氏管,却存在Amh和AmhrⅡ,那么其作用有待阐明。近年来,一些研究表明TGF-β信号通路成员在鱼类性别决定中起重要作用,如银汉鱼(Allanetta bleekeri)的Amhy、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的AmhrⅡ以及吕宋青鳉(Oryzias luzonensis)的GsdfY。尼罗罗非鱼是重要的世界性养殖鱼类,具有XX/XY性别决定类型,雄鱼比雌鱼生长快约50%,易于获得单性鱼苗以及全基因组测序已公开等优点,所以,尼罗罗非鱼是研究性别决定和分化分子机制的好材料,可以兼顾基础和应用两个方面研究。本实验室前期工作中克隆了尼罗罗非鱼的性别决定候选基因Amhy/Amh,但其决定性别的功能还有待验证。本研究拟通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除和转基因过表达两种方法,从正反两方面对Amhy/Amh进行功能研究,同时,从缺失功能研究其受体AmhrⅡ的功能,以期揭示Amhy/Amh和AmhrⅡ在尼罗罗非鱼性别决定中的作用。主要研究结果如下:1)利用CRISPR/Cas9靶向基因敲除技术在罗非鱼XY个体敲除Amhy/Amh,单条鱼最高突变率达到96%,最低为32%,平均为65%左右,亚克隆测序证实靶位点产生删除不同数目碱基的多种突变类型。常规组织学检测显示：XY对照组发育为精巢,而Amhy/Amh缺失导致XY个体性腺性逆转,发育为卵巢。免疫组化检测结果表明：在孵化后10、30、90天(days after hatching, dah)的Amhy/Amh缺失XY性腺中检测到XX性腺特异表达的雌激素合成关键酶芳香化酶Cypl9ala的表达,同时伴随着90 dah敲除鱼血清雌激素(E2)的上调,相反,没有检测到雄性精巢Sertoli细胞特异标记Dmrt1的表达。此外,对F1代XY敲除阳性鱼分析发现,Amhy和Amh单独缺失没有引起性逆转,然而Amhy和Y染色体上的Amh同时缺失的XY鱼性逆转为雌鱼。另一方面,在XX过表达含有Amhy/Amh fosmid质粒,导致XX个体性腺性逆转为精巢,免疫组化表明性逆转精巢中有Dmrt1表达,没有Cyp19a1a的表达。综上所述：位于Y染色体串接的Amhy/Amh是雄性性别决定所必须的。2)本研究成功从尼罗罗非鱼中分离出Amhy和Amh可能的受体AmhrⅡ基因,其开放阅读框长1515bp,编码504个氨基酸。同源性比对发现：鱼类AmhrⅡ的序列比较保守,都有保守的蛋白激酶结构域；共线性分析发现,尼罗罗非鱼和青鳉的相似性较高,然而,河豚和四足动物的相似性较低。通过RT-PCR和Real-time PCR研究AmhrⅡ在罗非鱼成鱼不同组织的表达模式,发现其仅在精巢和卵巢组织表达,且精巢的表达远远高于卵巢。利用实验室前期测定的5,30,90,180 dah的XX、XY性腺8个转录组数据分析显示AmhrⅡ在5 dah的XX、XY性腺中开始表达,且表达量相当,随后其表达升高,到30 dah达到最高值,之后逐渐下调,除5 dah外各时期都是雌性明显低于雄性。通过CRISPR/Cas9靶向基因敲除技术在罗非鱼XY个体敲除AmhrⅡ,单条的最高突变率达到68%,最低为22%,平均为48%。亚克隆测序进一步证实靶位点产生删除或插入不同数目碱基的多种突变类型。常规组织学检测显示,AmhrⅡ缺失导致XY个体性腺性逆转,发育为卵巢,具有Ⅰ、Ⅱ时相卵母细胞及卵巢腔,而XY对照组全部发育为精巢。免疫组化结果显示在10、30、90、180 dah AmhrⅡ缺失鱼性腺中检测到Cyp19a1a的表达,没有Dmrt1的表达。最后,采用酶联免疫吸附法检测XY个体缺失AmhrⅡ后血清雌激素水平,结果显示：与对照XY血清相比,3月龄敲除鱼雌激素水平上升,但未达到正常雌鱼的水平。这表明AmhrⅡ在介导Amhy/Amh决定雄性性别过程中起着重要作用。综上所述,本研究在XY个体敲除Amhy/Amh及其可能受体AmhrⅡ导致雄性向雌性的性逆转,而在XX个体过表达Amhy/Amh导致雌性向雄性的性逆转,此结果证明Amhy/Amh/AmhrⅡ是尼罗罗非鱼雄性性别决定的关键因子。结合银汉鱼、红鳍东方触和吕宋青鳉的研究表明TGF-β信号通路在鱼类性别决定中起重要作用。