本课题组前期研究发现,肿瘤细胞释放自噬小体（Tumor cell-released autophagosomes,TRAP）通过TLR2-My D88-NF-κB信号通路诱导B细胞分化为免疫抑制性IL-10+B细胞,抑制T细胞增殖和抗肿瘤免疫应答;并且,中性粒细胞通过大胞饮作用快速有效吞噬TRAP,产生ROS、活化caspase-3,诱导中性粒细胞凋亡,抑制T细胞增殖;另外,TRAP通过TLR4-My D88-p38-STAT3信号通路诱导M2型巨噬细胞极化,促进PD-L1和IL-10高表达,抑制T细胞增殖,促进肿瘤生长。由此可见,TRAP与肿瘤患者抑制性免疫功能的发生发展密切相关,而外周血TRAP含量是否可以反映肿瘤进程,值得深入研究。基于目前尚未有方法可以直接定量检测TRAP,且外周血中TRAP含量较少,需要高灵敏检测方法方能定量,因此,直接定量检测TRAP的新方法以及外周血TRAP含量与肿瘤的关系,有待进一步研究。目的:利用免疫传感器的高灵敏度和高特异性以及碳纳米材料的优良特性,研发新型免疫传感器,用以人或小鼠TRAP的纯化募集及其检测,为探究外周血TRAP含量与肿瘤疾病的关系奠定基础。方法:1.新型酶级联免疫传感器的设计、研发与应用利用多壁碳纳米管（MWCNTs）、多巴胺盐酸盐（DA）、氯金酸（HAu Cl4）制备碳纳米复合材料（MWCNTs-PDA-Au NPs）,作为免疫传感器的基底材料修饰于电极表面,同时将β-半乳糖苷酶（Gal）和酪氨酸酶（Tyr）的酶级联反应应用于免疫传感器。用透射电子显微镜、紫外-可见吸收光谱分别观察和分析碳纳米复合材料,验证其是否成功合成;用循环伏安法在六氨合钌氯溶液中验证碳纳米复合材料的性能;用计时库仑法在溶液相验证酶级联反应的可行性;用循环伏安法在铁氰化钾溶液中监测免疫传感器的构建;用免疫传感器定量检测模式抗原CEA并对免疫传感器进行方法学评价以及初步应用。2.特异性富集纯化TRAP纳米磁珠的设计与研发利用四氧化三铁（Fe3O4）磁性纳米粒子和金（Au）纳米粒子合成Fe3O4-Au复合物,偶联LC3B抗体后制备特异性富集纯化TRAP的纳米磁珠。用扫描电子显微镜和紫外-可见吸收光谱验证Fe3O4-Au复合物是否成功合成;用Western blot分析LC3B抗体的特异性;用激光共聚焦显微镜观察特异性富集纯化TRAP的纳米磁珠是否成功制备并分析其性能;用Western blot分析该纳米磁珠的富集TRAP的效率。3.基于氧化石墨烯水凝胶复合材料的新型免疫传感器的设计与研发用氧化石墨烯（GO）制备氧化石墨烯水凝胶（GH）,并与亚甲基蓝（MB）复合形成氧化石墨烯水凝胶-亚甲基蓝（GH-MB）复合物,作为免疫传感器的基底材料修饰于电极表面,与特异性富集纯化TRAP的纳米磁珠共同构成“三明治”型免疫传感器。用扫描电子显微镜和紫外-可见吸收光谱验证GH-MB复合物是否成功合成,并用循环伏安法在铁氰化钾溶液中验证GH-MB的性能;用Western blot和流式细胞术分析选择合适的LC3B抗体用以构建免疫传感器;用循环伏安法在铁氰化钾溶液中监测免疫传感器的构建;用免疫传感器定量检测模式抗原LC3B并对免疫传感器进行方法学评价;用构建的免疫传感器检测TRAP。4.基于氧化石墨烯水凝胶复合材料的新型免疫传感器检测TRAP及其应用的研究4.1新型免疫传感器检测肿瘤细胞株来源TRAP小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞数分别为3×10~2、1×10~3、3×10~3、1×10~4、3×10~4、1×10~5、3×10~5铺于24孔板,缺氧24 h后,用免疫传感器检测培养上清中TRAP浓度;小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞数为1×10~5铺于24孔板,分别缺氧12、24、48、72 h后,用免疫传感器检测培养上清中TRAP浓度;人肝癌Hep G2细胞株、小鼠淋巴瘤EL4细胞株、小鼠肝癌Hepa1-6细胞株、小鼠黑色素瘤B16F10细胞株、人乳腺癌MDA-MB-231细胞株细胞数为1×10~5铺于24孔板,缺氧培养24 h,用免疫传感器检测培养上清中TRAP浓度。4.2新型免疫传感器检测小鼠外周血来源TRAPC57BL/6小鼠尾静脉注射10 ng B16F10细胞来源TRAP,分别于10 min、20 min、30 min后采眼眶血,用免疫传感器检测小鼠血浆中TRAP浓度;C57BL/6小鼠尾静脉分别注射10 ng、30 ng、100 ng B16F10细胞来源TRAP,于10 min后采眼眶血,用免疫传感器检测小鼠血浆中TRAP浓度;用本课题组研发的肿瘤疫苗治疗4T1荷瘤小鼠,另一组用生理盐水作为安慰剂,于30天时分别采眼眶血,免疫传感器检测小鼠血浆中TRAP浓度。用透射电子显微镜观察TRAP特异性纳米磁珠富集荷瘤小鼠外周血中的TRAP。用Western blot鉴定纳米磁珠富集的TRAP。4.3新型免疫传感器检测人外周血来源TRAP收集12例肿瘤患者和12例健康人外周血,用免疫传感器检测血浆中TRAP浓度;用ELISA试剂盒检测这12例肿瘤患者和12例健康人外周血中IL-1β、IL-6、IL-10水平,并用Spearman法分析其与TRAP含量的相关性。结果:1.新型酶级联免疫传感器的设计、研发与应用透射电子显微镜显示碳纳米管（MWCNTs）成功复合聚多巴胺（PDA）之后负载了金纳米粒子（Au NPs）,紫外-可见吸收光谱显示碳纳米复合材料有金纳米粒子特征吸收峰,提示材料成功合成;循环伏安法显示碳纳米复合材料可放大电信号,增强导电性;在溶液相验证酶级联反应可行,苯基-β-D-半乳糖苷（P-GP）被Gal水解后可被Tyr催化氧化;循环伏安法显示免疫传感器构建成功,检测模式抗原CEA的线性范围为10 pg/m L-10 ng/m L,检出限为8.39 pg/m L（S/N=3）,特异性好、稳定性高,且免疫传感器与临床检测CEA常用方法检测结果接近,准确性高。2.特异性富集纯化TRAP纳米磁珠的设计与研发扫描电子显微镜显示Fe3O4成功合成且负载金纳米粒子之后表面分布大量深色颗粒,紫外-可见吸收光谱显示Fe3O4-Au复合物有Au特征吸收峰,提示复合物成功合成;Western blot结果显示LC3B Ab1特异性好,故选用其制备纳米磁珠;激光共聚焦显微镜观察发现特异性富集纯化TRAP的纳米磁珠制备成功且特异性好;Western blot结果显示该纳米磁珠富集TRAP效率高。3.基于氧化石墨烯水凝胶复合材料的新型免疫传感器的设计与研发扫描电子显微镜显示GH有特征多孔结构,紫外-可见吸收光谱显示GH-MB复合物有GH和MB的特征吸收峰,提示GH-MB复合物成功合成;循环伏安法显示GH-MB可增大电流,放大电信号;Western blot和流式细胞术分析不同LC3B抗体,发现LC3B Ab2抗体特异性好且与纳米磁珠偶联的LC3B抗体针对不同抗原表位,故将其用于免疫传感器构建;循环伏安法显示免疫传感器构建成功,检测模式抗原LC3B的线性范围为10 pg/m L-100 ng/m L,检出限为2.696 pg/m L（S/N=3）,且重复性与特异性好、稳定性高,可以用于TRAP的检测;用构建的免疫传感器检测TRAP,线性范围为60 pg/m L-600 ng/m L,检出限为15.739 pg/m L（S/N=3）,特异性好、准确性高且较稳定。4.基于氧化石墨烯水凝胶复合材料的新型免疫传感器检测TRAP及其应用的研究4.1新型免疫传感器检测肿瘤细胞株来源TRAP将不同数量的B16F10细胞缺氧24 h后,用免疫传感器检测培养上清中TRAP浓度,发现TRAP的浓度随细胞数量增多而升高,到1×10~5细胞数时TRAP的浓度不再升高;选择1×10~5细胞数的B16F10细胞缺氧培养12-72 h,用免疫传感器检测培养上清中TRAP浓度,发现细胞释放TRAP随培养时间增加而增多,24 h后TRAP浓度不再增加;人肝癌Hep G2细胞株、小鼠淋巴瘤EL4细胞株、小鼠肝癌Hepa1-6细胞株、小鼠黑色素瘤B16F10细胞株、人乳腺癌MDA-MB-231细胞株细胞数为1×10~5铺于24孔板,缺氧培养24 h,用免疫传感器检测培养上清中TRAP浓度,发现相对于无细胞的空白培养基,不同细胞株培养上清中均有TRAP,且浓度有一定差别。4.2新型免疫传感器检测小鼠外周血来源TRAPC57BL/6小鼠尾静脉注射10 ng B16F10细胞来源TRAP,于不同时间采眼眶血,用免疫传感器检测小鼠血浆中TRAP浓度,发现小鼠自体TRAP浓度很低,注射10 min时TRAP浓度最高,随后浓度逐渐降低;C57BL/6小鼠尾静脉分别注射不同量B16F10细胞来源TRAP,于10 min后采眼眶血,用免疫传感器检测小鼠血浆中TRAP浓度,发现随着注射TRAP的量增加,外周血中TRAP浓度逐渐增高;用本课题组研发的肿瘤疫苗治疗4T1荷瘤小鼠,与生理盐水作安慰剂组对比,于30天时采眼眶血,免疫传感器检测小鼠血浆中TRAP浓度,发现荷瘤小鼠PBS对照组外周血中TRAP浓度明显高于正常小鼠,经肿瘤疫苗治疗后的荷瘤小鼠外周血中TRAP浓度明显降低。透射电子显微镜显示TRAP特异性纳米磁珠成功富集荷瘤小鼠外周血中的TRAP。Western blot显示TRAP特异性纳米磁珠富集所得TRAP纯度高。4.3新型免疫传感器检测人外周血来源TRAP免疫传感器检测12例肿瘤患者和12例健康人血浆中TRAP浓度,发现肿瘤患者与健康人血浆中均含有TRAP,且肿瘤患者血浆中的TRAP含量明显高于健康人;ELISA检测12例肿瘤患者和12例健康人外周血中IL-1β、IL-6、IL-10水平,发现肿瘤患者血浆中的IL-6、IL-10水平高于健康人,而IL-1β水平与健康人没有明显差别,Spearman法分析其与TRAP含量的相关性发现,血浆中IL-6、IL-10水平与TRAP浓度呈明显正相关,而IL-1β水平与TRAP浓度没有明显相关性。结论:1.基于碳纳米管复合材料的酶级联免疫传感器研发成功,灵敏度高、特异性好,碳纳米管复合材料偶联抗体活性位点多,导电性好,有利于信号放大,酶级联反应体系相对于单酶体系检测的特异性好;2.特异性富集纯化TRAP纳米磁珠研发成功,抗干扰能力强、特异性好,富集TRAP的效率和纯度高;3.基于氧化石墨烯水凝胶复合材料的免疫传感器研发成功,性能优异,氧化石墨烯水凝胶复合材料不仅作为氧化还原探针,还可以偶联抗体及放大电信号,该免疫传感器可以用于TRAP检测;4.免疫传感器TRAP检测法可应用于:肿瘤细胞培养上清分泌型TRAP的检测;4T1荷瘤小鼠外周血中TRAP含量的检测以及肿瘤疫苗治疗效果的评估;肿瘤患者外周血中TRAP的含量检测,检测结果初步显示,肿瘤患者外周血中TRAP明显高于健康人,且外周血中IL-6、IL-10水平与TRAP含量存在一定相关性。