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腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷,对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用,是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷以及许多抗病毒性药物的重要中间体。目前在工业上主要以糖质为原料发酵进行生产。但国内腺苷的生产效率仍有较大的提高空间,可通过诱变育种以及基因工程的方法来改造菌种,优化发酵条件来改善和提高产量、降低成本;同时在生产过程中还存在生产菌株遗传性状和产量不稳等问题。本实验室保藏的一株能够积累腺苷的菌株Bacillus subtilis DI4-24,经过连续传代培养,菌种退化现象严重,其遗传性状组氨酸缺陷极易发生丢失,不利于腺苷的工业化生产。本研究以分离纯化后的退化菌株B.subtilis DI4-24R为出发菌株,利用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)进行诱变处理,重新获得了增加组氨酸缺陷型菌株,进行遗传性状稳定性和高产腺苷的选育,并首次尝试通过基因敲除技术定向改造菌株,来使生产菌株的稳定性能增强的研究。主要研究内容如下:1.菌种退化的原因分析。通过对高产腺苷菌株B.subtilis DI4-24分离纯化和遗传表型分析,得到菌落形态和遗传标记都发生改变的退化菌株B.subtilis DI4-24R,其产苷性能退化的原因为组氨酸缺陷型高频率地发生回复突变所致,退化菌菌株产量大幅度降低至4.34 g/L。2.以B.subtilis DI4-24R为出发菌株,进行ARTP诱变处理,经过初筛选到his-恢复的突变株。实验表明,ARTP诱变放电照射10 s诱变效果最佳,正变率高。经过复筛得到了一株高稳产腺苷菌株B.subtilis AR-27,传代6次该菌株依然保持相当高的产腺苷能力,摇瓶发酵产苷量达到15.84 g/L,比出发菌株产量提升了近3倍,his-回变率大幅下降至9.3×10-8,其产苷性能和遗传稳定性得到显著提高。3.对突变菌株B.subtilis AR-27进行了摇瓶发酵培养基的优化试验,通过生长因子、葡萄糖、以及氮源物质的单因子实验和多因素正交试验,确定了最佳培养基配方为:葡萄糖11 g/L、豆粕80 mL/L、玉米浆60 mL/L、酵母精粉12 g/L、氯化铵15 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、硫酸镁0.3 g/L、硫酸亚铁0.02 g/L、硫酸锰0.02 g/L、氯化钙5 g/L、碳酸钙20 g/L、亮氨酸0.02 g/L、谷氨酸0.02 g/L、组氨酸50 mg/L。在优化的培养基中产苷水平达16.12 g/L,产苷能力提高了10%。4.在NCBI上检索出枯草芽孢杆菌his C基因序列,以此为根据分别设计上下游引物,PCR扩增DI4-24R细胞基因组,得到上游(TF)与下游(TB)的同源序列,将上下游同源序列融合连接,片段大小为1000 bp左右,将目的片段与T载体连接,构建成重组质粒T-H。5.提取穿梭质粒载体pMAD和重组质粒,分别用限制性内切酶BamH、BglⅡ酶切后,采用新技术in-fusion处理后,转化到DH5α细胞,筛选得到hisC基因缺失的同源重组质粒pMAD-H。将同源重组质粒pMAD-H电转化导入受体细胞DI4-24R中,用抗性平板筛选克隆子,得到B.subtilis DI4-24R(pMAD-H)转化菌株,为后续的同源重组工程菌的筛选奠定了基础。