【摘 要】
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目的:建立“Cocktail”探针药物法及体外肝微粒体孵育体系测定大鼠肝微粒体中CYP1A2和CYP3A4酶活性,明确附子药对及其代表方剂对大鼠体内细胞色素P45 0（CYP45 0）酶活性的影响。通过从蛋白水平及分子生物学水平上阐明附子不同配伍对CYP450酶蛋白表达和基因表达的影响,探索附子配伍减毒的分子机制,为附子安全有效的临床应用提供科学支持,同时为毒性中药配伍减毒提供新的研究思路,进一步
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目的:建立“Cocktail”探针药物法及体外肝微粒体孵育体系测定大鼠肝微粒体中CYP1A2和CYP3A4酶活性,明确附子药对及其代表方剂对大鼠体内细胞色素P45 0（CYP45 0）酶活性的影响。通过从蛋白水平及分子生物学水平上阐明附子不同配伍对CYP450酶蛋白表达和基因表达的影响,探索附子配伍减毒的分子机制,为附子安全有效的临床应用提供科学支持,同时为毒性中药配伍减毒提供新的研究思路,进一步使科学研究与临床相结合。方法:将雄性大鼠随机分为空白组、单味药组、附子药对组、复方组（含有附子药对的方剂）,所有大鼠均连续给药处理七天,均于第八天取肝脏,分别进行各部分实验。采用“Cocktail”探针药物法进行CYP450酶活性测定实验,选择CYP1A2和CYP3A4的特异性探针底物咖啡因和咪达唑仑制备成“Cocktail”溶液,建立同时测定两种探针底物的体外肝微粒体孵育体系。通过RP-HPLC法测定两种探针底物在大鼠肝微粒体孵育体系中的浓度,评价附子不同配伍组对CYP1A2和CYP3A4酶活性的影响并通过实验结果筛选出对酶活性有诱导作用的实验组。CYP450酶含量测定实验,采用CO还原差示光谱法利用紫外分光光度计和酶标仪等仪器测定大鼠肝微粒体中CYP450酶含量,评价各实验组对CYP450酶含量的影响。CYP450酶mRNA基因表达实验,大鼠经颈椎脱臼法处死后,立即取出其肝脏并提取各组肝脏总RNA,经RNA质量鉴定后,采用逆转录聚合酶链反应RT-PCR技术测定大鼠肝脏CYP1A2和CYP3A4酶mRNA基因的表达量。结果:1.本课题所建立的“Cocktail”探针药物法体外肝微粒体孵育体系,可以同时测定两种探针底物咖啡因和咪达唑仑在肝微粒体中的药物浓度,各吸收峰互不干扰,分离完全,线性关系良好,精密度,准确度等方法学考察项目均符合生物样品检测要求。2.通过实验各组对CYP450酶活性影响的实验结果,筛选出对CYP1A2或CYP3A4酶有诱导作用的实验组,有干地黄系列（干地黄组,附子配伍干地黄组,肾气丸组）,芍药系列（芍药组,附子配伍芍药组,真武汤组）,防风系列（防风组,附子配伍防风组,桂枝芍药知母汤组）。研究结果显示每一系列单味药,附子药对及其方剂之间对酶活性的影响具有一致性。3.各实验组（酶活性部分筛选出对酶活性有诱导作用的实验组系列）对CYP450酶含量以及对mRNA基因表达影响的实验。（1）CYP450酶含量结果表明:除附子组与空白组比较CYP450酶含量降低,有统计学差异（P<0.05）,真武汤组对CYP450酶含量变化没有影响。其他各组与空白组比较,CYP450酶含量均增加（P<0.05）。（2）mRNA基因表达实验结果:除附子组,干地黄系列（干地黄组,肾气丸组）,防风系列中（防风组,附子防风组）外,其它各组对CYP1A2酶基因表达均有显著或极显著的诱导作用。除芍药系列中（芍药组,附子芍药组）,防风系列（桂枝芍药知母汤组）外,其它各组对CYP3A4酶基因表达均有显著或极显著的诱导作用。结论:1.基于肝药代谢酶的角度验证了芍药,防风,干地黄与附子配伍后能够诱导CYP1A2或CYP3A4酶活性,加快附子毒性成分的代谢,达到附子减毒作用。2.附子不同配伍对CYP450酶活性的影响,与各组对CYP450酶含量,mRNA基因表达量的影响有相关性,推测CYP450酶含量的变化,mRNA表达的调控可能是拮抗附子毒性作用机制之一。3.基于肝药代谢酶的角度研究附子配伍减毒的机制证实了传统中医药配伍理论的科学性与合理性,为揭示传统中药配伍理论及临床合理配伍用药提供直接依据。
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