【背景与目的】通过组织工程技术实现牙周组织的再生、以修复由各种原因所造成的牙周组织缺损,是牙周病治疗的终极目标。支架材料在能够最大化细胞治疗疗效的同时,提高移植成功率、改善新生组织机械强度及控制细胞/生长因子的释放,是牙周再生研究中的关键问题。水凝胶(hydrogels)是一种由亲水性集团相互交联构成的网络支架材料,因其与细胞外基质(ECM)有诸多相似性,能够良好的支持那些附着于其表面、或包裹于其中的细胞的各种生物学行为,因而已被广泛用于牙周组织工程支架的研究。近年来开发的一种新型的光敏水凝胶材料—甲基丙烯酸酐化明胶(Gel MA)得到了学者们的广泛青睐,其优点包括:结构上具有细胞粘附位点及基质金属蛋白酶水解位点,故可良好支持细胞的增殖及迁徙;甲基丙烯酸酐基团的存在使其具有光敏性,能够在紫外光照射下快速交联;理化性能灵活可调;能够通过诸多微制造工艺,如生物打印、光刻技术、自组装、微流体技术等,制造出具有独特形貌特点的结构单元等。Gel MA水凝胶已被证明在骨、软骨、心肌、血管等组织再生方面的独特优势,并且在基础细胞研究、细胞信号转导、药物/基因控释及生物感应等领域亦取得了较好的结果。另外,牙周组织作为牙齿的支持结构单元,始终处于活跃的力学微环境中。大量研究报道了外部力学刺激与牙周膜生理、病理过程的联系。研究指出,适当的力学刺激可以促进(干)细胞活性及增殖,并可通过改变干细胞所处力学微环境达到控制干细胞定向分化的目的。由此可见,深入理解牙周膜细胞与其所处力学微环境的相互作用机理,找出牙周膜细胞的最适力学参数,必将有助于实现牙周组织再生。本研究旨在:(1)制备表征Gel MA水凝胶,遴选出最适宜人牙周膜干细胞(h PDLSCs)生长繁殖的各项理化参数;(2)基于Gel MA水凝胶的光敏性,开发出个体化三维力学加载生物反应器,并通过此设备对h PDLSCs进行三维拉伸加载,研究在三维条件下不同应变及频率对细胞活性及增殖状态的影响;(3)以Gel MA水凝胶及n HA为主要组分,通过冻干技术制备Gel MA/n HA复合水凝胶支架材料,载入h PDLSCs后,对其体外增殖、分化,以及体内组织再生情况进行探索。【方法】1.首先按照前人经验制备并合成Gel MA水凝胶前体;场发射电子扫描显微镜观察不同单体浓度Gel MA水凝胶表面形貌,并测定材料孔隙率及孔径;Instron万能试验机检测不同单体浓度水凝胶的杨氏模量及溶胀比;随后应用微光刻技术制备Gel MA微凝胶阵列;原代分离并培养h PLDSCs,而后将其包裹于Gel MA微凝胶阵列中;通过免疫荧光染色技术比较了不同单体浓度及紫外光照时间对h PLDSCs活性的影响。2.基于Gel MA水凝胶的光敏特性,通过直流微型电机、直线导轨、偏心凸轮、有机玻璃板等结构机械制造、组装个体化力学三维加载生物反应器;应用此个体化三维力学加载生物反应器对包裹于Gel MA微凝胶阵列中的h PDLSCs进行不同频率及应变的三维拉伸实验,观察细胞的活性及增殖情况。3.将不同浓度n HA与Gel MA单体混合后,通过冻干技术制备出一系列浓度配比的Gel MA/n HA复合水凝胶支架材料;Instron万能试验机检测其杨氏模量;SEM观察其内部超微结构;将h PDLSCs载入支架中,采用MTT检测细胞活性,Brd U掺入法检测细胞增殖,茜素红染色及RT-PCR检测细胞的分化;随后将载有h PDLSCs的复合凝胶支架材料植入裸鼠皮下进行体内试验,应用HE染色、马松三色染色以及SEM观察样本内部结构,评估其体内组织再生能力。【结果】1.成功制备出Gel MA水凝胶白色泡沫状单体,在UV及光引发剂的条件能够快速交联,并成功制备出Gel MA水凝胶微阵列。FE-SEM观察Gel MA水凝胶支架表面形貌可见表面平滑连续、孔径均一、相互连通的多孔三维网络状结构。随着单体浓度的增加,其机械性能(杨氏模量)亦增加,而溶胀比、孔径、及孔隙率却相应的降低。成功原代分离培养出h PDLSCs,将其包裹于Gel MA水凝胶三维培养一定天数后发现,增加UV光照时间会显著降低细胞活性,而不同Gel MA单体浓度对细胞活性无显著性影响。2.成功构建出个体化力学三维加载生物反应器,能够实现对细胞进行不同应变、不同频率的三维拉伸加载等功能。通过比较不同应变、不同频率加载方式对h PDLSCs的影响,我们发现5%应变量的静态拉伸能够显著提高凝胶内细胞活力,促进细胞增殖;而不同频率的动态拉伸则对细胞的活力、增殖无明显影响。3.成功制备了5%及10%两种不同单体浓度的Gel MA/n HA水凝胶复合支架材料,每一种包含n HA浓度依次为1%、5%、10%。SEM观察可见n HA团块具有较好的分散性,表明n HA与Gel MA凝胶网络结合良好;随着Gel MA单体浓度的升高,水凝胶支架的孔径会显著下降。Gel MA单体浓度的提高会显著增强水凝胶支架的刚度特性,且n HA含量的增高亦会增大复合水凝胶支架的杨氏模量。MTT和Brd U掺入实验结果表明,n HA的混入对细胞活性没有显著影响,但却影响了细胞的增殖能力。随后,茜素红染色和RT-PCR结果表明,未混入n HA的Gel MA水凝胶支架中的细胞基本不会向成骨细胞分化,而混入n HA的支架材料显著促进了h PDLSCs的成骨分化能力。从成骨分化标志基因的表达亦可看出,当n HA含量为5%w/v时,h PDLSCs的分化能力最为活跃。裸鼠体内试验结果表明,Gel MA/n HA复合凝胶支架在局部没有引发炎性反应,说明具有较好的生物安全性;HE及马松三色染色结果均提示样本内部发生了不同程度的矿化反应,其中5%n HA组可见粗大的新生骨基质贯通整个样本内部;SEM结果表明,随着n HA含量的增加,样品内部矿化程度亦随之增加。在各组样本中均可观察到h PDLSCs粘附于支架上,对照组、1%及5%组样本中亦可见大量毛细血管及RBC,提示n HA具有一定的诱血管生成作用。【结论】光敏水凝胶Gel MA是一种理想的软物质生物材料,具有良好的生物安全性、相容性、可降解性,其理化性能简易可调,能够良好地支持h PLDSCs在其中的三维生长。基于Gel MA水凝胶光敏特性开发出的个体化力学三维加载生物反应器具有行程可控、路径垂直、高通量、易重复等优点;因其能够在微纳米尺度对三维培养的细胞进行高通量的加载和观察,领先国内外同类加载模型,适宜今后开展三维水平的细胞生物力学研究。Gel MA/n HA复合水凝胶支架材料具有良好的生物相容性及一定的促进h PDLSCs矿化分化以及粗血管再生的作用,能够作为今后牙周再生研究领域的备选支架。