研究背景：　　 肝细胞癌(以下简称肝癌)是常见的消化道恶性肿瘤，是世界上肿瘤致死率最高的恶性肿瘤之一。由于肝癌起病隐匿、早期诊断困难、发生发展迅速等原因，很多患者在就诊时已处于肿瘤的中晚期，即使是接受了手术和/或放疗、化疗，预后依然很差。虽然随着现代对肿瘤基础研究的深入、影像学检查技术的不断进步、新抗癌药物的开发及多种辅助诊疗手段的出现，人类对肝癌的认识和诊治已经取得了长足进步，但是肝癌患者的总体预后情况仍没有得到明显的改善。影响肝癌患者预后的重要因素，就是肝癌的转移和复发。　　 在肝癌的诊断方面，目前应用较多的早期诊断和筛查指标仍旧是血清中的甲胎蛋白(AFP)检测。虽然AFP对肝癌的早期诊断具有很重要的意义，然而它却不能很好地用于预测肝癌的转移和复发。迄今为止，还没有灵敏的、特异的血清学指标，可用于评价肝癌的预后，也没有找到能准确预测肝癌转移和复发的肿瘤标志物。因此，要想改善肝癌的治疗效果，改善肝癌患者的预后，就必须找到快捷、可靠、灵敏、特异的生物学标志物，从而做到及早治疗肝癌和选择最合适的治疗方式。　　 血液中富含多种的蛋白质，这些蛋白质几乎来自于人体内的各种组织、细胞，甚至来自肿瘤、炎性组织形成、细菌和病毒感染等。因此，血液中蛋白质的变化可以反映出人体在各种生理和病理状态下的变化情况。再加上血液样本的获取方便、检测快捷，因此是临床上用于疾病诊断、病情监控和预后判断的重要检测对象。蛋白质组学，是对一个细胞、组织或个体某一时空表达的全部蛋白质进行系统研究的科学。近年来，蛋白质组学的研究技术发展迅速，并已被研究者广泛应用于筛选肿瘤相关的蛋白质分子的研究中，发现了大量传统手段无法检测到的新型肿瘤标志物，提高了人们对肿瘤的认识和临床诊治的水平。　　 本研究通过双向电泳(2-DE)联合基质辅助激光解吸离子化-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)的蛋白质组学研究方法，对肝内转移和未转移肝癌患者以及正常人的血清进行分析，鉴定出肝内转移和未转移肝癌患者血清中表达有差异的蛋白质，并筛选可能作为肝癌转移的血清学标志物。进一步，本研究对筛选出来的可能作为诊断肝癌转移的血清学标志物进行了大样本量的临床与实验验证，以明确该蛋白用于早期诊断肝癌转移的可行性。　　 目的：　　 1.建立和优化肝癌患者血清的双向电泳(2-DE)体系，为筛检肝癌患者血清转移相关蛋白奠定基础。　　 2.运用优化的后的技术，分析肝内未转移和转移肝癌患者血清蛋白质组的表达差异。　　 3.筛选可作为肝癌转移诊断或预后判断的潜在标志物。　　 研究方法：　　 1.病例收集：收集正常健康对照、肝内转移肝癌和未转移患者血清，肝癌组织样本；乙肝、乙肝肝硬化患者血清，胃癌患者血清，结肠癌患者血清，食管癌患者血清样本。并整理患者的病例资料。　　 2.优化血清双向电泳的方法：取HCC患者血清，首先使用不同浓度ACN预处理，然后去除白蛋白和免疫球蛋白等高丰度蛋白质，再进行双向电泳(2-DE)分析，检测不同浓度ACN预处理后蛋白质的检测数量差异。　　 3.肝癌血清蛋白质组分析：取正常对照、肝内转移和未转移肝癌患者的血清各12例，进行优化后的2-D DIGE分析和MS分析，寻找表达有显著性差异的蛋白质，筛选可能作为肝癌血清标志物的蛋白质。　　 4.标志物的筛选和验证：在收集的所有血清和组织样本中，用western blot、免疫组织化学、RT-PCR等方法验证筛选的潜在标志物的有效性和特异性。　　 5.通过ELISA方法，确定正常人、肝癌患者、其他肿瘤及乙肝、肝硬化脏疾病患者血清中该标志物表达水平，并统计分析计算ROC的工作点，并构建ROC曲线；计算ROC曲线下面积及其标准误，并进行统计校验以判断潜在标志物诊断价值的大小。　　 结果：　　 1.共收集正常健康对照血清100例，有效的肝内转移肝癌和未转移患者血清各50例，肝癌组织标本24例；乙肝、乙肝肝硬化患者血清各20例，胃癌患者血清16例，结肠癌患者血清11例，胆管癌患者血清4例。整理了完整的患者病例资料信息。　　 2.血清经0％、20％和30％浓度的ACN预处理后，进行2-DE分析发现蛋白质斑点的检出数量分别为532±96、623±102和674±123，乙腈预处理能有效增加蛋白质的检测数量。　　 3.正常对照、肝内转移和未转移肝癌患者的血清各12例，经过2-D DIGE和MS分析发现，与肝内未转移肝癌患者和正常成人血清相比，肝内转移肝癌患者血清中有17种蛋白质有显著性表达差异，其中有fibulin-1等4个蛋白质表达上调，K10等13个蛋白质表达下调。　　 4.以fibulin-1为研究对象，经western blot和免疫组织化学实验证实，在肝转移肝癌患者的血清和组织中，fibulin-1的表达量都有显著性升高。　　 5.通过酵母表达fibulin-1蛋白作为标准品，利用间接ELISA方法测定fibulin-1在正常人、肝内转移肝癌患者及未转移患者、其他消化道肿瘤、乙肝、肝硬化患者血清中fibulin-1的含量，并进行统计校验判断潜在标志物诊断价值的大小。　　 6.ROC分析示：肝癌转移的诊断界值为45.85μg/mL，诊断灵敏度为0.56，特异度为0.93。　　 结论：　　 1.使用乙腈预处理血清的方法，可有效提高血清蛋白质在进行2-DE时的检出量。　　 2.Fibulin-1在肝内转移肝癌患者血清呈高表达，并具有一定特异性，可作为血清中判断肝癌转移的潜在生物学标志物。